生化技术课件第一章生命大分子物质的制备

生化技术课件第一章生命大分子物质的制备第一页，共八十九页，编辑于2023年，星期日生物大分子

(biomacromolecule)通常是指动物、植物和微生物在进行新陈代谢时产生蛋白质和核酸等有机化合物的总称。特点：具有较大的分子量、由简单的小分子排列组成、具有复杂的空间结构、生物大分子的生物活性由结构决定。阐明生物大分子复杂的结构及结构与功能的关系是生物学的主要任务。第二页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题。生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。第三页，共八十九页，编辑于2023年，星期日生物大分子的制备有以下主要特点：与化学产品的分离制备相比较：⑴蛋白质的组成、结构极其复杂，分子差异大导致分离、纯化和鉴定有难度和特殊性；核酸较之要简单。⑵通常以复合物的形式存在，提取分离困难。⑶许多生物大分子离开了生物体环境就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，是生物大分子提取制备最困难之处。第四页，共八十九页，编辑于2023年，星期日⑷许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。⑸生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物，方法的通用性较差。正是这些特点致使蛋白质的分离纯化和分析的难度极大。第五页，共八十九页，编辑于2023年，星期日生物大分子制备的一般过程：①根据要制备的生物大分子的目的和要求，选择和处理合适的材料。②确立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。③有效成分的抽提。第六页，共八十九页，编辑于2023年，星期日④粗品的纯化。⑤纯品的鉴定（纯度、量）。⑥产物的浓缩、干燥和保存。第七页，共八十九页，编辑于2023年，星期日①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。③各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。首要了解生物大分子的理化性质：第八页，共八十九页，编辑于2023年，星期日④固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。⑥对其他生物分子的特殊亲和力。第九页，共八十九页，编辑于2023年，星期日蛋白质的理化性质蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的胶体性质蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固蛋白质的紫外吸收第十页，共八十九页，编辑于2023年，星期日目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和离心三大技术。第十一页，共八十九页，编辑于2023年，星期日材料的选择与处理第一节第十二页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。所选用的材料主要依据实验目的来确定。选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。一、材料的选择第十三页，共八十九页，编辑于2023年，星期日有效成分：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。杂质：有效成分以外的其他物质的统称。第十四页，共八十九页，编辑于2023年，星期日例一：胰岛素的提取含量：牛胰腺>猪胰腺来源：猪>牛成本：牛>猪

综合结果：选用猪胰腺作为材料。第十五页，共八十九页，编辑于2023年，星期日例二：酸性磷酸酶分离纯化与活性测定含量：小麦的胚芽中含量高第十六页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

材料尽可能保持新鲜，尽快加工处理，以防有效成分降解、破坏，必要时可冷冻、干燥处理。1、动物组织

必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。

二、材料的处理第十七页，共八十九页，编辑于2023年，星期日冰冻

-70℃保存备用较好干燥

第十八页，共八十九页，编辑于2023年，星期日2、植物材料

必须清洗,去壳，脱脂，并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。如叶片:直接洗净植物种子:泡胀或粉碎第十九页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

3、微生物：种类多，繁殖快、培养简便、易诱变、不受季节的影响，是常用的材料。应注意它的生长期。在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况：（1）微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等（2）菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等第二十页，共八十九页，编辑于2023年，星期日另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存；对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备；第二十一页，共八十九页，编辑于2023年，星期日第二节

确立测定方法第二十二页，共八十九页，编辑于2023年，星期日一、目的与要求生物大分子的两个重要特征：极易失活和含量极微测定方法应该：

简便、灵敏、准确、快速、专一第二十三页，共八十九页，编辑于2023年，星期日分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理化学的测定方法。生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；二、常用的测定方法第二十四页，共八十九页，编辑于2023年，星期日物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。第二十五页，共八十九页，编辑于2023年，星期日1、光谱法不同的生命大分子物质与相应波长的光会发生特定的作用，依据作用结果可推断出被测物质的含量和部分理化性质，这类测定方法为光谱法。所需的样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛用于物质的含量测定。紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法第二十六页，共八十九页，编辑于2023年，星期日紫外光谱法

利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性质而建立的一种方法。将一定浓度的待测物溶液，通过某一特定波长的紫外分光光度计，测定此溶液的消光值即可换算出待测物的浓度。

1.测定核酸含量

2.测定蛋白质的含量及纯度第二十七页，共八十九页，编辑于2023年，星期日芳香族氨基酸的紫外吸收第二十八页，共八十九页，编辑于2023年，星期日测定核酸\蛋白质的含量:

OD260=1.0相当于

50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）

20μg/ml寡核苷酸测定核酸\蛋白质的纯度:DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0第二十九页，共八十九页，编辑于2023年，星期日可见光光谱法有色物质溶液的颜色与其浓度有关。溶液的浓度越大，颜色越深。利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定溶液的浓度。可见光光谱法是基于有色溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法。将待测物与相关试剂或酶作用后的有色产物置于相应的可见光波长下，即测定其消光值。第三十页，共八十九页，编辑于2023年，星期日例如：测定某一蛋白质溶液的浓度方法：蛋白质与相关试剂（如双缩脲试剂）作用后产生特定颜色的物质（紫色络合物），紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，于波长540nm处进行比色测定。最后与标准品比对即可计算出该待测蛋白质溶液的浓度第三十一页，共八十九页，编辑于2023年，星期日第三十二页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

利用有些生命大分子物质自身可以吸收特定光波的能量后，发出荧光的特性而建立的一种方法。精确性重复性灵敏度比吸收光谱法好荧光光谱法第三十三页，共八十九页，编辑于2023年，星期日浊度法主要用于悬浮液的测定。测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。不被吸收，主要是散射、反射。第三十四页，共八十九页，编辑于2023年，星期日光谱法电化学法生物活性检测法免疫分析法生物传感器吸收光谱法荧光法浊度法直接测定法比色法第三十五页，共八十九页，编辑于2023年，星期日第三节细胞的破碎第三十六页，共八十九页，编辑于2023年，星期日不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。第三十七页，共八十九页，编辑于2023年，星期日一、机械破碎1.研磨法：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。第三十八页，共八十九页，编辑于2023年，星期日2.组织捣碎器法：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。

注意温度的影响第三十九页，共八十九页，编辑于2023年，星期日二、物理法：1.超声波法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长久一些。第四十页，共八十九页，编辑于2023年，星期日2.压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1.77×108Pa～3.54×108Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。第四十一页，共八十九页，编辑于2023年，星期日3.冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。第四十二页，共八十九页，编辑于2023年，星期日三、化学与生物化学方法：1.自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2.溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。第四十三页，共八十九页，编辑于2023年，星期日3.有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。4.酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。

第四十四页，共八十九页，编辑于2023年，星期日第四节抽提第四十五页，共八十九页，编辑于2023年，星期日一、抽提抽提：指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性。第四十六页，共八十九页，编辑于2023年，星期日提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；溶剂的pH值和提取时间等。第四十七页，共八十九页，编辑于2023年，星期日二、抽提有效成分的影响因子稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。第四十八页，共八十九页，编辑于2023年，星期日1)pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。远离等电点的pH值，溶解度增加。通常，碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂。第四十九页，共八十九页，编辑于2023年，星期日2)溶剂的极性和离子强度：离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。有些蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。第五十页，共八十九页，编辑于2023年，星期日为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低；增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。通常，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂。

相似相溶第五十一页，共八十九页，编辑于2023年，星期日3)水解酶：无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少。加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。第五十二页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性；加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力；还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。第五十三页，共八十九页，编辑于2023年，星期日4)温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。温度升高，溶解度加大。第五十四页，共八十九页，编辑于2023年，星期日5)搅拌：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。第五十五页，共八十九页，编辑于2023年，星期日6)氧化：因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团。若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。还有金属离子、提取液的比例等因素第五十六页，共八十九页，编辑于2023年，星期日第五节浓缩第五十七页，共八十九页，编辑于2023年，星期日1.沉淀法:沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。第五十八页，共八十九页，编辑于2023年，星期日2.吸咐法:

通过吸咐剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩所用的吸咐剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等。第五十九页，共八十九页，编辑于2023年，星期日3.超滤:超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留。最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。第六十页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。第六十一页，共八十九页，编辑于2023年，星期日4.透析法:

在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量通常为1万左右。第六十二页，共八十九页，编辑于2023年，星期日半透膜阻留蛋白质分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。第六十三页，共八十九页，编辑于2023年，星期日5.蒸馏法:减压加温蒸发浓缩:通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。第六十四页，共八十九页，编辑于2023年，星期日6.空气流动蒸发浓缩:空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。第六十五页，共八十九页，编辑于2023年，星期日7.冰冻干燥法:生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻真空干燥,适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存。第六十六页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。第六十七页，共八十九页，编辑于2023年，星期日第六十八页，共八十九页，编辑于2023年，星期日第六节纯化方案的设计与评价第六十九页，共八十九页，编辑于2023年，星期日

由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。

第七十页，共八十九页，编辑于2023年，星期日1.分离纯化方法的选择制备生物大分子的方法分类如下：①以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。②以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。一、纯化方案的设计第七十一页，共八十九页，编辑于2023年，星期日③以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。④以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。第七十二页，共八十九页，编辑于2023年，星期日切忌！重复使用同一种分离纯化方法。第七十三页，共八十九页，编辑于2023年，星期日分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。2.分离纯化方法的排布:第七十四页，共八十九页，编辑于2023年，星期日⑴早期分离纯化

1)特点：①粗提取液中物质成份十分复杂;②欲制备的生物大分子浓度很稀;③物理化学性质相近的物质很多;④希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质;第七十五页，共八十九页，编辑于2023年，星期日2)对所选方法的要求：①要快速、粗放;②能较大地缩小体积;③分辨力不必太高;④负荷能力要大;第七十六页，共八十九页，编辑于2023年，星期日3)可选用的方法：①吸附；②萃取；③沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；④离子交换（批量吸附、胖柱交换）、亲和层析。第七十七页，共八十九页，编辑于2023年，星期日⑵晚期分离纯化：

分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，并尽可能在低温下（如在冷室中）进行。

第七十八页，共八十九页，编辑于2023年，星期日可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。第七十九页，共八十九页，编辑于2023年，星期日每一步都要进行测定有效成分的含量；比活力；(活力单位数/毫克蛋白)纯化倍数；(每步的比活力/粗抽提液比活力）收得率；(每步的总活力/粗抽提液总活力）二、纯化方案的评价第八十页，共八十九页，编辑于2023年，星期日步骤总蛋白/g总活性/U比活性/（U/mg）纯化倍数收得率%1.粗抽体液30.0210000.71.01002.氯化锰处理7.64150172.02.8723.冰冻融解5.58148722.73.8714.DEAE-纤维素层析0.113502544.563.5245.硫酸铵盐析0.048336771.7102.0176.羟基磷灰石柱层析0.0163133200.0286.0157.聚丙烯酰