生化工程双水相萃取

生化工程双水相萃取第一页，共三十九页，编辑于2023年，星期日1.双水相萃取的概述1.1双水相的形成

双水相萃取法又称水溶液两相分配技术，它是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。如葡聚糖（dextran）与聚乙二醇（PEG）按一定比例与水混合，溶液混浊，静置平衡后，分为互不相溶的两个水相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖。第二页，共三十九页，编辑于2023年，星期日SubtitleText11.2双水相萃取的特点1.双水相萃取的概述优势：有助于保持生物活性；易于放大，可以按比例放大；回收效率高，耗能较少，速度快；操作条件温和（常温常压）；易于连续化操作，设备简单。成本较高；易乳化；不易定量控制；高聚物回收困难。不足：第三页，共三十九页，编辑于2023年，星期日1.双水相萃取的概述1.3双水相的类型1）高聚物-高聚物(PEG-Dextran)

易于与后续处理连接2）高聚物-盐(PEG-(NH4)2SO4)

盐浓度高，蛋白质易盐析，废水处理困难3）非离子表面活性剂水胶束（TritonX-114）成分简单，易于回收4）阴阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）-十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）分离某一生物大分子，两相系统的选择原则，必须有利于目的物的萃取和分离，同时又要兼顾到聚合物的物理性质。如甲基纤维素和聚乙烯醇，因其粘度太高而限制了它们的应用。PEG和Dextran因其无毒性和良好的可调性而得到广泛应用。第四页，共三十九页，编辑于2023年，星期日1.双水相萃取的概述1.4常用的双水相体系第五页，共三十九页，编辑于2023年，星期日2.双水相萃取的原理当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，在上相和下相间进行选择性分配，其分配规律服从Nernst分配定律：CT、CB分别代表上相和下相溶质的浓度。当相系统固定时，分配系数K是一常数，与溶质浓度无关。2.1分配定律第六页，共三十九页，编辑于2023年，星期日2.双水相萃取的原理2.2形成机理两种聚合物相互混合两个因素1体系熵的增加2分子间作用力分层（聚合物的不相容性）混合富含不同聚合物的两相第七页，共三十九页，编辑于2023年，星期日2.3相图双水相的形成条件和定量关系常用相图表示。2.双水相萃取的原理TCB称为双节线，双节线以上的区域为两相区。上相组成用T(Top)表示，下相组成用B(Bottom)表示。连接T、B两点的线段TB称为系线，系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则。PEG／Dex体系相图两相区均相区双节线系线第八页，共三十九页，编辑于2023年，星期日如点M为整个系统的组成，该系统实际上由T、B所代表的两相组成，VT表示上相体积，VB表示下相体积，则：

VT／VB＝BM／MT

系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大。当点M向下移动时，系线长度缩短，两相差别减小，到达C点时，系线长度为0，两相间差别消失而成为一相，因此C点为系统临界点(criticalpoint)。2.双水相萃取的原理第九页，共三十九页，编辑于2023年，星期日双水相系统的相图可由实验测定：2.双水相萃取的原理

将一定量的高聚物P浓溶液置于试管内，然后用已知浓度的高聚物溶液Q来滴定。随着高聚物Q的加入，试管内溶液由均相突然变混浊，记录Q的加量。然后再在试管内加入lml水，溶液又澄清，继续滴加高聚物Q，溶液又变混浊，计算此时系统的总组成。以此类推，由实验测定一系列双节线上的系统组成点，以高聚物P浓度对高聚物Q浓度作图，即可得到双节线。第十页，共三十九页，编辑于2023年，星期日2.4分配系数2.双水相萃取的原理溶质在两水相间的分配主要由其表面性质决定，通过在两相间的选择性分配而得到分离。分配能力的大小可用分配系数K来表示。K=Ct/CbCt、Cb分别为被萃取物质在上、下相的浓度，mol/L。

决定分配系数的因素包括很多，如粒子大小、疏水性、表面电荷、粒子或大分子的构象等，这些因素微小的变化可导致分配系数较大的变化，因而双水相萃取有较好的选择性。第十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.影响物质分配的因素3.1聚合物的种类及相对分子质量的影响3.2pH的影响3.3离子环境对蛋白质在两相系统分配的影响3.4温度的影响3.5生物分子疏水基团的影响3.6系线长度的影响第十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.影响物质分配的因素3.1聚合物的种类及相对分子质量的影响不同聚合物两水相系统显示出不同的疏水性，这种差别对目的产物与相的相互作用有重要影响。同一聚合物的疏水性随相对分子质量的增加而增加。第十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.影响物质分配的因素两水相萃取糖化酶，PEG平均相对分子质量（MPEG）↑，分配系数K。两水相萃取糖化酶MPEG=400时，K>1，酶主要分布于上相

MPEG>400时，K<1，酶主要分布于下相

主要原因是随着MPEG↑，羟基数目↓，疏水性↑，使糖化酶在上相的表面张力↑，从而转入下相。第十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期日PEG分子对不同分子量蛋白质K的影响3.影响物质分配的因素第十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.影响物质分配的因素第十六页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.影响物质分配的因素3.2pH的影响第一，pH值会影响蛋白质分子所带电荷的性质和数量。第二，pH值影响磷酸盐的离解程度，从而改变H2PO4-和HPO42-

之间的比例，进而影响相间电位差。这样蛋白质的分配因pH值的变化发生变化。pH值的微小变化会使蛋白质的分配系数改变2～3个数量级。

pH值对分配的影响源于两个方面的原因：第十七页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.影响物质分配的因素3.3离子环境对蛋白质在两相系统分配的影响

如果粒子带有电荷，并在两相中分配不相等时，就会在相间产生电位，称为道南电位(DonnanPotential)。可用下式表示：

式中:U2、U1——分别表示相2和相1的电位；Z+、Z-——分别表示一种盐的正、负离子的离子价；，——正、负离子不带电时两相间的分配系数；F——法拉第常数；

R——气体常数，J/(molK)T——温度，K第十八页，共三十九页，编辑于2023年，星期日当一种盐的正、负离子对两相有不同的亲和力，即时,就会产生电位差；↑，电位差就↓。电位差的变化，也会对分配系数产生影响.蛋白质在两相的分配系数可由下式表示：

式中，K0是在无电位差时的分配系数；ZP为净电荷。3.影响物质分配的因素第十九页，共三十九页，编辑于2023年，星期日通过测定两相中无机盐正负离子浓度，就可求出电位差，进而求得目标物的分配系数。表阴阳离子在两相中的分配系数注：相体系为8%（质量分数）PEG4000和8%（质量分数）Dextran，200C，零界面势。3.影响物质分配的因素第二十页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.影响物质分配的因素3.4温度的影响温度影响双水相系统的相图，从而影响蛋白质的分配系数。温度越高发生相分离所需的高聚物浓度越高。在临界点附近对双水相体系形成的影响更为明显。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，1～2℃的温度改变不影响目标产物的萃取分离。第二十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期日大规模操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于：（a）成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质不会发生变性；

(b)常温下溶液粘度较低，容易相分离；

(c)常温操作节省冷却费用。3.影响物质分配的因素第二十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.5生物分子疏水基团的影响3.影响物质分配的因素对于同一种双水相体系，微生物也会影响体系上下相的比例以及胞内蛋白质在体系的分配系数。这种分配的差异主要是由细胞破碎程度引起的，细胞壁和细胞膜不同的化学结构也会导致体系上下相比例的改变。此外，因为PEG是一种常见的絮凝剂和沉淀剂，细胞物质的絮凝和在不同相中的分配同时发生。所以PEG的存在改变了物质的溶解曲线。第二十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期日3.6系线长度的影响3.影响物质分配的因素系线长度受到相高聚物浓度的影响。由相图可知，a.系线长度0时，上相和下相组成相同，K=1.0；b.系线长度，上相和下相相对组成差别，被分离物质在两相中的表面张力也，从而影响K。第二十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期日4.双水相萃取技术的应用4.1蛋白质、酶的纯化第二十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期日4.双水相萃取技术的应用一般的萃取方法难以得到β-干扰素，但可以通过PEG-磷酸酯/盐双水相系统来萃取。

4.3β-干扰素的提取双水相萃取特别应用于从一些粘度大、难过滤、易乳化的发酵液中分离纯化小分子，如乙酰螺旋霉素，青霉素，红霉素等。主要采用PEG/盐系统。4.2分离纯化小分子第二十六页，共三十九页，编辑于2023年，星期日4.4人生长激素的提取4.双水相萃取技术的应用

用PEG40006.6%/磷酸盐14%体系从E.Coli碎片中提取人生长激素(hGH)，当pH值=7，菌体含量为为1.35%(W/V)干细胞，混合5~10s后，即可达到萃取平衡，hGH分配在上相，其分配系数高达6.4，收率大于60%。若进行三级错流萃取，总收率可达81%.第二十七页，共三十九页，编辑于2023年，星期日4.双水相萃取技术的应用4.5病毒的分离和纯化当病毒进入双水相体系后，在上相和下相间也会发生选择性分配，表现出一定的分配系数。控制不同的NaCl浓度可以使病毒全部分配在上相([NaCl]=1mol)、全部分配在下相([NaCl]=0.15mol)或彼此分开([NaCl]=0.3~0.5mo1)，从而实现各种病毒的提取、纯化和反萃取。。第二十八页，共三十九页，编辑于2023年，星期日4.双水相萃取技术的应用4.6生物活性物质的分析检测利用双水相萃取技术分析某种生物分子，常需要另一种与其定量复合的分子，只要复合物和反应物之一在双水相体系中具有不同的分配系数并最好能分配在不同相中，就能更好地进行分析。双水相萃取分析技术己成功地应用于免疫分析、生物分子间相互作用的测定和细胞数的测定。第二十九页，共三十九页，编辑于2023年，星期日5.双水相萃取技术的进展5.1廉价双水相体系的开发生物工程中得到应用的两种双水相体系，即高聚物／高聚物和高聚物/盐体系。两种体系比较见下表。从表可见，高聚物/高聚物体系对活性物质变性作用小，界面吸附少，但价格高。因而寻找廉价的高聚物/高聚物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要发展方向。第三十页，共三十九页，编辑于2023年，星期日目前比较成功地是用变性淀粉PPT代替昂贵的Dextran。PPT-PEG体系已被用于从发酵液中分离过氧化氢酶、β-半乳糖甘酶等。PPT-PEG体系比PEG-盐体系稳定，和PEG-Dextran体系相图非常相似，并具有以下优点：（1）蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，而在PEG浓度大于5％时，溶解度显著地减小。（2）黏度小。PPT的动力粘度只是粗Dextran的1/2，因而可以大大改善传质效果。（3）价格便宜。5.双水相萃取技术的进展第三十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期日5.双水相萃取技术的进展5.2双水相萃取技术同其他分离技术结合5.2.1双水相体系同生物转化相结合5.2.2

双水相萃取同膜分离结合5.2.3双水相萃取同亲和层析相结合—亲和双水相

5.2.4双水相萃取与细胞破碎过程相结合

5.2.5

双水相萃取与电泳技术的结合第三十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期日5.双水相萃取技术的进展5.2.1双水相体系同生物转化相结合将双水相萃取同生物转化结合在一起，可解决在许多生物转化中存在的两个问题：一是由于双水相体系对菌体及酶没有毒性，同时又可将产物萃入上相，所以可消除产物抑制效应；二是使分布在下相的细胞(酶)循环使用，从而为固定化细胞及酶的应用开辟了新路。第三十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期日5.双水相萃取技术的进展5.2.2双水相萃取同膜分离结合

利用中空纤维膜传质面积大的特点,将膜分离与双水相萃取相结合,可以大大加快萃取传质速率。利用膜将双水相体系隔开,可解决双水相萃取的乳化和生物活性物质在界面的吸附问题。因此,将膜分离同双水相萃取技术相结合,是解决双水相体系易乳化问题及加快萃取速率的有利手段。第三十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期日5.双水相萃取技术的进展双水相萃取同膜分离结合例子：从表中可见，酶的分配系数较大，传质系数虽与传统溶剂萃取过程相差不大，在10-6～10-4cm／s范围内，但由于中空纤维膜传质面积大，因而大大地加快了萃取传质速率。第三十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期日5.双水相萃取技术的进展5.2.3双水相萃取同亲和层析相结合—亲和双水相亲和双水相，即在