特殊毒性及其试验与评价方法

特殊毒性及其试验与评价方法第一页，共八十四页，编辑于2023年，星期日第一节致突变作用及其试验与评价方法一、基本概念二、突变类型三、突变的发生与修复机制四、致突变试验与致突变作用评价第二页，共八十四页，编辑于2023年，星期日

1．DNA与基因DNA由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构。

遗传学基础第三页，共八十四页，编辑于2023年，星期日

基因（gene）：DNA分子中最小的完整功能单位，是生物遗传信息的携带者基因组（genome）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质第四页，共八十四页，编辑于2023年，星期日

2、染色质与染色体

在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质。它由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量的RNA组成，形似串珠状的复合体。第五页，共八十四页，编辑于2023年，星期日在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并折叠成染色体，故染色质与染色体是由相同物质组成的；染色体存在于细胞中，通常只有在细胞分裂时经过特殊染色才能清楚地看到。第六页，共八十四页，编辑于2023年，星期日2009-6-30染色体与基因有着平行的关系①染色体可以在显微镜下看到。②染色体成对存在，基因也成对存在。③个体中成对的基因一个来自母本，另一个来自父本。④不同对基因形成配子时的分离与不同对染色体在减数分裂期的分离，都是独立分配的。第七页，共八十四页，编辑于2023年，星期日3、基因型与表型

基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。第八页，共八十四页，编辑于2023年，星期日细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。G0：DNA合成前期；

G1：DNA合成期；

S：完成DNA复制；

G2：为有丝分裂做准备；

M：有丝分裂期4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂第九页，共八十四页，编辑于2023年，星期日

有丝分裂过程有丝分裂指细胞核分裂的过程，一个细胞由此生成两个子细胞，每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的染色体。第十页，共八十四页，编辑于2023年，星期日减数分裂过程第十一页，共八十四页，编辑于2023年，星期日第十二页，共八十四页，编辑于2023年，星期日生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续，这个过程称为遗传。遗传的稳定是相对的。在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为变异。一、基本概念第十三页，共八十四页，编辑于2023年，星期日造成生物变异的原因有：

①亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生；②由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源；③由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。第十四页，共八十四页，编辑于2023年，星期日自发突变

(spontaneousmutation)

是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。特点：自发突变的发生过程长，频率极低,与物种的进化有关。诱发突变

(inducedmutation)

是指人为的造成突变。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生新的表型效应称为突变。第十五页，共八十四页，编辑于2023年，星期日突变的分类基因突变(genemutation)：一个或几个DNA碱基对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。染色体畸变(chromosomeaberration)：染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。染色体结构改变染色体数目改变第十六页，共八十四页，编辑于2023年，星期日二、突变类型遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤：基因突变染色体畸变第十七页，共八十四页，编辑于2023年，星期日基因突变一个或几个DNA碱基对的改变。染色体畸变染色体的结构及数目改变。端粒姊妹染色单体着丝粒组蛋白双螺旋碱基对端粒第十八页，共八十四页，编辑于2023年，星期日这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA以外的靶组织受损所致。基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本质是相同的，其区别在于受损程度。第十九页，共八十四页，编辑于2023年，星期日通常以光学显微镜的分辨率0.2µm来区分基因突变和染色体畸变。基因突变是用光学显微镜观察不到的，须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断，而染色体畸变可用光学显微镜进行观察。第二十页，共八十四页，编辑于2023年，星期日1.基因突变基因突变指基因中DNA序列的变化。因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。第二十一页，共八十四页，编辑于2023年，星期日①碱基置换

指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。

第二十二页，共八十四页，编辑于2023年，星期日第二十三页，共八十四页，编辑于2023年，星期日②移码突变

移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。第二十四页，共八十四页，编辑于2023年，星期日③整码突变

指在DNA中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。④片断突变

指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。第二十五页，共八十四页，编辑于2023年，星期日2.染色体畸变指染色体的结构异常和数目异常，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。第二十六页，共八十四页，编辑于2023年，星期日（1）染色体结构异常有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，可在机体或细胞群传递。第二十七页，共八十四页，编辑于2023年，星期日容易观察到的畸变有染色单体断裂、染色体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、双中心粒染色体、环状染色体及某些相互易位。第二十八页，共八十四页，编辑于2023年，星期日染色体畸变裂隙(gap)断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)微小体(minutebody)无着丝点环环状染色体双着丝点染色体倒位(inversion)易位(translocation)插入(insertion)和重复(duplication)辐射体第二十九页，共八十四页，编辑于2023年，星期日染色体结构变异类型染色体缺失,如果蝇的缺刻翅染色体重复,如果蝇的棒状眼染色体倒位染色体易位,

如夜来香的变异

第三十页，共八十四页，编辑于2023年，星期日在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的染色体仍保持线状连接者为裂隙。

指染色体上狭窄的非染色带，无线状连接者为断裂。带宽超过染色单体宽度。①裂隙（gap）和断裂（break）第三十一页，共八十四页，编辑于2023年，星期日一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺失和中间缺失。②无着丝粒断片（fragment）、缺失（deletion）第三十二页，共八十四页，编辑于2023年，星期日染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体。③环状染色体（ringchromosome）第三十三页，共八十四页，编辑于2023年，星期日当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180再重接，称为倒位。④倒位（inversion）第三十四页，共八十四页，编辑于2023年，星期日当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。如果此时有缺失的染色体和插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。⑤插入（insertion）和重复（duplication）第三十五页，共八十四页，编辑于2023年，星期日两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。⑥易位（translocation）第三十六页，共八十四页，编辑于2023年，星期日（2）染色体数目异常

整倍性畸变：单、三、四、多倍体

非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或少多条

2n-1,2n-2,…2n+1,2n+2,…

第三十七页，共八十四页，编辑于2023年，星期日类型公式染色体组整倍体单倍体n(ABCD)二倍体2n(ABCD)(ABCD)三倍体3n(ABCD)(ABCD)(ABCD)四倍体4n(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)非整倍体单体2n-1(ABCD)(ABC)三体2n+1(ABCD)(ABCD)(A)四体2n+2(ABCD)(ABCD)(AA)双三体2n+1+1(ABCD)(ABCD)(AB)缺体2n-2(ABC)(ABC)染色体数目异常的基本类型注：A、B、C、D代表非同源染色体第三十八页，共八十四页，编辑于2023年，星期日DNA修复直接修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复光修复错配碱基修复碱基切除修复核苷酸切除修复复制后修复呼救性修复三、突变的发生与修复机制外源化学物引起基因突变和染色体突变的靶部位主要是DNA，而导致染色体数目异常的靶部位主要是有丝分裂和减数分裂器，如纺锤丝。第三十九页，共八十四页，编辑于2023年，星期日致突变作用（mutagenesis）：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。致突变物：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。又称为遗传毒物。四、致突变试验与致突变作用评价第四十页，共八十四页，编辑于2023年，星期日观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来进行。主要目的：①检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性；②检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性。第四十一页，共八十四页，编辑于2023年，星期日观察项目的选择基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(geneticmdpoint)。第四十二页，共八十四页，编辑于2023年，星期日正常DNADNA损伤DNA修复过程未修复的DNA损伤表达断裂的DNA分子染色体结构异常基因突变细胞死亡非整倍体多倍体重组事件

SCE有丝分裂性交换染色体分离异常细胞屏障遗传毒物无误修复易错修复细胞分裂突变发生中的事件及遗传学终点的关系第四十三页，共八十四页，编辑于2023年，星期日常用的致突变试验1、细菌回复突变试验（Ames试验）2、哺乳动物细胞基因突变试验3、果蝇伴性隐性致死试验4、染色体畸变分析5、微核试验6、姐妹染色单体交换试验7、显性致死试验8、小鼠可遗传易位试验9、细菌DNA修复试验10、程序外DNA合成实验11、精子畸形试验12、小鼠特异基因座试验第四十四页，共八十四页，编辑于2023年，星期日第四十五页，共八十四页，编辑于2023年，星期日致突变试验组合的原则一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。第四十六页，共八十四页，编辑于2023年，星期日以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受试物引起其回复突变的作用。试验菌株： 鼠伤寒沙门氏菌——Ames试验 大肠杆菌——大肠杆菌回复试验1、细菌回复突变试验第四十七页，共八十四页，编辑于2023年，星期日Ames试验原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养琼脂平板上不能生长。第四十八页，共八十四页，编辑于2023年，星期日鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突变株(his-)正向突变回复突变代谢活化系统受试物第四十九页，共八十四页，编辑于2023年，星期日有点试验和掺入试验两种。应分别进行不加及加代谢活化系统的试验，常用为S9混合液，即用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆经9000g离心得到的上清液，再加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子。第五十页，共八十四页，编辑于2023年，星期日Ames试验标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变，TA100检测碱基置换突变，TA102对醛、过氧化物和DNA交联剂较敏感。这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，检测时提高试验敏感性。Ames试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。第五十一页，共八十四页，编辑于2023年，星期日

突变型试验菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变成野生型(his+)

，即恢复了合成组氨酸的能力，可在此平板上生长成可见菌落。

如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。第五十二页，共八十四页，编辑于2023年，星期日结果判断只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。第五十三页，共八十四页，编辑于2023年，星期日哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培养细胞的基因正向突变试验。

常用细胞株选用的基因座小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）TK、HPRT

中国仓鼠卵巢组织细胞（CHO）HPRT

中国仓鼠肺组织细胞（V79）HPRT

人淋巴细胞HPRT

2.哺乳动物细胞基因突变试验(mammaliancellgenemutationassay)第五十四页，共八十四页，编辑于2023年，星期日TK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷＋ATP→胸苷酸。存在嘧啶类似物5-溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。受试物存在时若细胞不死亡说明TK发生突变。（1）TK基因座第五十五页，共八十四页，编辑于2023年，星期日次黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次黄嘌呤＋鸟嘌呤＋磷酸核糖焦磷酸→核苷-5’-单磷酸（NMP），补充途径。如存在碱基类似物，生成相应的NMP，掺入到DNA中可致死。加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变——HPRT-。（2）HPRT基因座第五十六页，共八十四页，编辑于2023年，星期日制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogeneticassay)。染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。3.染色体畸变试验第五十七页，共八十四页，编辑于2023年，星期日体内试验：多观察骨髓细胞，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、DNA修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。第五十八页，共八十四页，编辑于2023年，星期日体外试验：常用中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和V79等细胞系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞。第五十九页，共八十四页，编辑于2023年，星期日2009-6-30上一内容回主目录返回下一内容返回

上一内容下一内容回主目录第六十页，共八十四页，编辑于2023年，星期日试验步骤染毒：健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40mg/kg体重腹腔注射。收获细胞：处死动物前2~4h，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸NS约5ml插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以1500r/min离心10min，弃上清液。低渗：打散沉淀物，加入预温37℃的0.075mol/LKCl约6ml，混匀，于37℃低渗15~20min，再加固定液l~2ml混匀，立即以1000r/min离心10min，弃上清液。第六十一页，共八十四页，编辑于2023年，星期日固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温10~20min，然后1000r/min离心10min，去上清液。同样方法再固定一次，弃上清液，留约0.5ml。制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的载波片10~15Cm高处滴片，干燥，用10％Giemesa染色液染色10~20min，轻微冲洗，自然晾干。阅片计数。第六十二页，共八十四页，编辑于2023年，星期日染色体数目改变包括：整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如3n或4n等。非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂(B)、碎片(F)、环形(r)、交换(E)以及复合性断裂等。小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为40条，大鼠的染色体数为42条。读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。第六十三页，共八十四页，编辑于2023年，星期日第六十四页，共八十四页，编辑于2023年，星期日染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形。4、微核（micronucleus）试验第六十五页，共八十四页，编辑于2023年，星期日第六十六页，共八十四页，编辑于2023年，星期日无核细胞红细胞有核细胞中微核难与正常核分叶及核突出物区别微核试验第六十七页，共八十四页，编辑于2023年，星期日常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)或外周血细胞进行微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。一般采用多次染毒后24h采样。第六十八页，共八十四页，编辑于2023年，星期日红细胞的分化成熟过程第六十九页，共八十四页，编辑于2023年，星期日第七十页，共八十四页，编辑于2023年，星期日第七十一页，共八十四页，编辑于2023年，星期日MNNCEIllustrationofabinuclearhumanlymphocytecontainingamicronucleus(arrow).Nuclearmaterialappearsinyellow,cytoplasminred.Acridin-Orangestaining,fluorescencemicroscopy,enlargement1000fold第七十二页，共八十四页，编辑于2023年，星期日试验步骤健康成年ICR小鼠，实验前24h予环磷酰胺40mg/kg腹腔注射染毒。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块混匀。以1000r/min速度离心10min，弃上清液，留下约0.5ml沉淀物混匀后，滴片两张，推片。将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾干。将固定晾干后的骨髓片，用Giemsa应用液染色10~15min，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。显微镜观察并计数微核率。第七十三页，共八十四页，编辑于2023年，星期日PCE呈灰蓝色，成熟RBC呈粉红色，NC呈蓝紫色。PCE中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数1000个PCE中含微核的PCE数。微核率（‰）=含微核PCE细胞数PCE细胞总数×1000第七十四页，共八十四页，编辑于2023年，星期日Giemsa染色PCE胞质内含有核糖体，染色呈灰蓝色；MCN多数为圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。NCEPCE&MCN第七十五页，共八十四页，编辑于2023年，星期日结果分析与评价本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE为评价细胞毒性的指标：正常PCE/NCE比值约为l（正常范围为0.6～1.2）；如PCE/NCE＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如PCE/NCE＜0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。第七十