东华大现代环境监测技术课件04荧光及磷光光谱法

第四章荧光及磷光光谱法4.1原理4.2荧光光谱仪4.3荧光分析方法4.4荧光光谱法在环境监测中的应用4.5磷光分析法

4.1原理4.1.1荧光和磷光的产生4.1.2激发光谱、荧光和磷光光谱4.1.3荧光的影响因素4.1.4荧光强度

4.1.1荧光和磷光的产生

&分子荧光是指分子在辐射能（紫外、可见光、红外光等）的照射下，电子跃迁至单重激发态，并以无辐射驰豫方式回到第一单重激发态的最低振动能级，由此再跃回基态或基态中的其它振动能级时所发出的光。

&分子磷光是指处于第一最低单重激发态的分子以无辐射驰豫方式进入第一最低三重激发态，再由三重激发态跃迁回至基态而发出的光。

&单重态(S)与三重态(T)的区别在于：电子自旋方向不同，且后者的能级稍低一些（见示意图）。单重激发态电子的自旋方向仍然和处于基态轨道的电子配对，且单重态分子具有抗磁性；三重激发态中，两个电子平行自旋。

单重态及三重态激发示意图

&处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指热的形式辐射其多余的能量，包括振动驰豫（VR），内部转移（IR），系间窜跃（IX）及外部转移（EX）等。各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。激发能量的传递途径如图所示。

激发态能量传递途径&结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递方式（荧光发射、磷光发射、振动驰豫、内部转移、系间窜跃、外部转移）在其中所起的作用。设处于基态单重态的电子吸收波长为

的辐射之后，分别激发至第二单重态S2和第一单重态S1，如图所示。

荧光、磷光能级图①振动驰豫指在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量一热的形式发出。发生振动驰豫的时间为10-12s。②内转移当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。③荧光发射处于第一激发单重态中的电子跃迁回至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-6～10-9s内完成。注意基态中也有振动驰豫跃迁。④系间窜跃指不同多重态间的无辐射跃迁。这是产生延迟荧光的机理。例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜越时，电子由S1的较低震动能级转移至T1的较高振动能级处。有时也可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。⑤磷光发射电子由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转到第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光。这个跃迁过程（T1→S0）是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4～100s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间⑥外转移指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。

Back4.1.2激发光谱、荧光和磷光光谱

荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长。这可根据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发光波长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系，即得到激发光谱曲线。在激发光谱的最大波长处，处于激发态的分子数目是最多的，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光。如果固定激发光波长为其最大激发波长处，然后测定不同波长时所发射的荧光或磷光强度，即可得到荧光或磷光光谱曲线（参见萘的激发光谱、荧光和磷光发射光谱曲线图）。

在荧光和磷光的产生过程中，因存在多种形式的无辐射跃迁而损失了部分能量，故它们的最大发射波长都向长波长方向转移；尤其磷光波长的移动较多，而且它的强度也相对较弱。萘的激发光谱、荧光和磷光光谱4.1.3荧光的影响因素

荧光的影响因素包括：量子产率、荧光与有机化合物结构的关系、金属鳌合物的荧光、溶剂的影响、荧光的淬灭。&

量子产率量子产率（Φ）通常用下式表示：也叫荧光效率。荧光的量子产率，与荧光产生时涉及的辐射和无辐射跃迁过程的速率常数有关。若用数学表达式表达这些关系，既

式中：Kf为荧光发射过程的速率常数，主要取决于化学结构；为其它过程的速率常数的总和，主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。&荧光与有机化合物结构的关系

①跃迁类型

因跃迁具有较大的摩尔吸收系数且寿命较短，故此过程常能发生较强的荧光；另外各种跃迁过程的竞争也有利于荧光的发射。

②共轭效应

容易实现Л→Л*

激发的芳香族化合物易发生荧光。增加分子体系的共轭度，也就是增大荧光物质的摩尔吸收系数，可使荧光增强，

③刚性结构和共平面效应荧光物质的刚性和共平面性增加，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小，从而有利于荧光的发射。

④取代基效应

芳香族化合物具有不同取代基时，其荧光强度和荧光光谱都有很大的不同。一般，给电子基团如：-OH、-NH2、-OCH3、-NR2等增强荧光；而吸电子基团如-NO2、-COOH等减弱荧光。&金属鳌合物的荧光

除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐金属离子是不能产生荧光的。但有些情况下，金属鳌合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测定。

①鳌合物中配对体的发光不少有机化合物具有共轭双键，但因不是刚性结构，分子处于同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成鳌合物，随着分子的刚性增强，平面结构增大，常会发生荧光。一般说来，能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构，如Be、Mg、Al、ZR、Th等。

②鳌合物中金属离子的特征荧光

通常是鳌合物先通过配位体电子跃迁而被激发，接着配位体把能量转移给金属离子，导致金属离子发射特征荧光。&溶剂的影响

增大溶剂的极性，将使n→Л*

跃迁的能量增大，Л→Л*跃迁的能量降低，从而导致荧光增强。

&荧光的淬灭

荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光淬灭。这些引起荧光强度降低的物质称为淬灭剂。

引起荧光淬灭的原因包括：①碰撞淬灭（主要原因）:指单重激发态的荧光分子与淬灭剂发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生淬灭作用。②能量转移:产生于淬灭剂与处于激发单重态的荧光分子作用后，发生能量转移，使淬灭剂得到激发。③氧的淬灭作用：顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光物质分子相互作用，促进形成顺磁性的三重态荧光分子，即加速系间窜跃所致。④自熄灭和自吸收：当荧光物质浓度较大时，常会发生自熄灭现象，使荧光强度降低。

4.1.4荧光强度发射的荧光光强IF应正比于该系统吸收的激发光的光强，即：

式中：I0是入射光强度，I是通过厚度为b的介质后的光强。常数K′取决于荧光效率。根据比耳定律：当I0一定时，经过一定转换，可写为：

在低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系。当高浓度时，由于自熄灭和自吸收等原因，使荧光强度与分子浓度不呈线性关系，而发生直线弯曲现象。

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4.2荧光光谱仪（荧光光度计）荧光分析使用的仪器可分为：目视、光电、分光三种类型。荧光光度计的组成：通常均由光源、单色器（滤光片或光栅）、液槽及检测器组成。重点掌握荧光光度计的工作原理和仪器结构图

荧光光谱仪示意图荧光光度计的工作原理：由光源发出的光，经第一单色器（激发光单色器）后，得到所需要的激发光波长。通过样品池后，由于一部分光线被荧光物质所吸收，故其透射强度减为I。荧光物质被激发后，将向四面八方发射荧光，但为了消除入射光及散射光的影响，荧光的测量应在与激发光成直角的方向上进行。仪器中的第二单色器称为荧光单色器。它的作用是消除溶液中可能共存的其它光线的干扰，以获得所需要的荧光。荧光作用于检测器上，得到相应的电讯号，经放大后，再用适当的记录器纪录。4.2.1光源

应具有强度大、适用波长范围宽两个特点。常用光源有高压汞灯和氙弧灯。前者的平均寿命约为1500～3000h，荧光分析中常用的是365、405、436nm三条谱线；后者是连续光源，发射光束强度大，可用于200～700nm波长范围。在300～400nm波段内，光谱强度几乎相等。4.2.2滤光片和分光器

用滤光片为单色器时，以干涉滤光片的性能最好。它具有半宽度窄，透射率高，经得起强光源的长期照射等优点。较精密的荧光光度计均用分光器作单色器。目前，分光器多采用光栅。4.2.3检测器

简易的荧光剂可采用目视或硒光电池检测。但一般较精密的荧光光度计均采用光电倍增管或光电子计数器检测。

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4.3荧光分析方法

4.3.1分析方法

多采用标准曲线法，即以已知量的标准物质经过和试样同样的处理后，配成一系列的标准溶液，测定这些溶液的荧光强度后，用荧光强度对标准溶液浓度绘制标准曲线，然后根据试样溶液的荧光强度，在标准曲线上求出试样中荧光物质的含量。4.3.2荧光分析法的灵敏度

荧光法的灵敏度比分光光度法高2～4个数量级。这是由于在分光光度法中，被检测的讯号为A=lgI0/I，即当试样浓度很低时，检测器所检测的是两个较大的讯号（I0及I）的微小差别，这是难以达到准确测量的。然而在荧光光度法中，被检测的是叠加在很小背景值上的荧光强度，从理论上讲，它是容易进行高灵敏、高准确测量的。在荧光光度法中，一般情况下，多采用相对灵敏度来表示。Back4.4荧光光谱法在环境监测中的应用

※大气SO2中的测定

※空气中苯并（α）芘的测定

※水环境中苯并(α)芘[BaP]的测定

※水质中硒的测定—2,3二氨基萘荧光

※大气SO2中的测定

紫外荧光法测定大气中的SO2，具有选择性好、不消耗化学试剂、适用于连续自动监测等特点，用波长190～230nm紫外光照射大气样品，则SO2吸收紫外光被激发至激发态，发射荧光强度和SO2浓度成正比，用光电倍增管及电子测量系统测量荧光强度，即可得大气中SO2的浓度（SO2检测仪示意图）。※空气中苯并（α）芘的测定乙酰化滤纸层析—荧光分光光度法

醋酸纤维素薄层层析—荧光分光光度法

SO2荧光监测仪示意图※水环境中苯并(α)芘[BaP]的测定

苯并(α)芘是一种有代表性的强致癌物质，被列为环境污染致癌物质监测工作中的常规项目之一。水中的苯并(α)芘主要采用层析—荧光分光光度法（GB11895-89）测定，将水中多环芳烃及环己烷可溶物经环己烷萃取（水样必须充分摇匀），萃取液用无水硫酸钠脱水、浓缩，然后经乙酰化滤纸分离。分离后的B(a)P用荧光分光光度计测定。※水质中硒的测定—2,3二氨基萘荧光（GB11902-89）

4.5磷光分析法

4.5.1原理

4.5.2磷光分析仪器

4.5.3分析方法

4.5.4在环境监测中的应用

4.5.1原理磷光发射电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，但由第一激发单重态的最低震动能级，有可能以系间蹿跃方式转至第一激发三重态，再经振动弛豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回到基态时，便发射磷光。增强磷光的措施由于磷光的产生很容易受其它辐射或无辐射跃迁的干扰而使磷光强度减弱，甚至完全消失。因此，为了获取较强的磷光，可采用下列一些措施：

①增加试样的刚性；②固体磷光法；

③分子缔合物的形成；④重原子效应；

⑤敏化磷光

此外，与间接荧光法一样，也可以利用磷光猝灭的效应，用间接磷光法测定某些物质。

4.5.2磷光分析仪器

磷光仪与荧光仪相似，主要有光源、激发光单色器、液槽、发射光单色器、检测器等组成。磷光计与荧光计的主要区别：液槽：为了能在低温下测定磷光，盛试样溶液的石英液槽需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶内。斩波片：因发生磷光的物质常伴有荧光产生，为了区别磷光和荧光，在其激发光单色器和液槽之间以及液槽和发射光单色器之间各装一个可调节为同相或异相的斩波片，并由一个同步电动机带动。同相时，磷光和荧光一起进入发射光单色器，测到的是磷光和荧光的总光强。当调节为异相时，