现代分子生物学笔记朱玉贤

第一章绪论分子生物学分子生物学的基本含义(p8)是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。分子生物学与其它学科的关系成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。生物化学与分子生物学关系最为密切:传统生物化学的中心内容是代谢，包括糖、脂类、氨基酸、核苷酸、以及能量代谢等与生理功能的联系。分子生物学则着重阐明生命的本质 主要研究生物大分子核酸与蛋白质的结构与功能、生命信息的传递和调控。细胞生物学与分子生物学关系也十分密切:法。的分子机理，这在某种程度上是向细胞生物学的靠拢。第一章序论1859年发表了《物种起源》，用事实证明“物竞天择，适者生存”的进化论思想。个认识到生物世界的不连续性。不可磨灭的贡献。细胞学说细胞学说的建立及其意义的基本单位。经典遗传学统一律：当两种不同植物杂交时，它们的下一代可能与亲本之一完全相同；分离规律：将不同植物品种杂交后的F1代种子再进行杂交或自交时，下一代就会按照一定的比例分离，因而具有不同的形式。1865年发表《植物杂交试验1900现代遗传学Morgan及其助手第一次将代表某一特性的基因同染色体联系起来，使科学界普遍认识了染色体的重要性并接受了孟德尔的遗传学原理。Morgan特别指出：种质必须由某些独立的要素组成，我们把这些要素称为遗传因子或基因。第二节分子生物学发展简史准备和酝酿阶段2050对生命本质的认识上的两点重大突破：1．确定了蛋白质是生命的主要基础物质2．确定了生物遗传的物质基础是DNA现代分子生物学的建立和发展阶段（20世纪50年代初到70年代初）1953WatsonCrickDNA子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。在此期间的主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识DNA双螺旋发现的意义：确立了核酸作为信息分子的结构基础；提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；础。Crick于1954年所提出遗传信息传递的中心法则CentralDogma：初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段（20世纪70年代后至今）基因工程技术的出现作为标志。其间的重大成就包括：DNA基因组研究的发展基因表达调控机理细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域第三节分子生物学的主要研究内容一．DNA重组技术（recombinantDNAtechnology）DNA使后者获得新的遗传性状或表达出所需要的产物。DNA重组技术的应用：利用微生物基因工程生产重组基因工程药物转基因植物和动物体细胞克隆基因表达与调控的基础研究二．生物大分子的结构功能研究基因组、蛋白质组与生物信息学基因组(Genome)：细胞或生物体一条完整单体的全部染色体遗传物质的总和。人类基因组计划HumanGenomeProject,HG：测定出人基因组全部DNA31095-10基因组、蛋白质组与生物信息学蛋白组计划（Proteomeproject）整个生物个体全部蛋白质及其功能。生物信息学的科学。四．基因表达调控研究第二章染色体与DNA本章内容染色体DNADNA原核生物和真核生物DNADNADNA第一节染色体(chromosome)概念：染色体(chromosome原核生物及细胞器在内的基因载体的总称。染色质(chromatin)：由DNA和蛋白质构成，在分裂间期染色体结构疏松，称为染色质。其实染色质与染色体只是同一物质在不同细胞周期的表现。(euchromatin(hypersensitive异染色质(heterochromatin)：在间期核中处于凝缩状态，无转录活性，也叫非活动染色质 chromatin)，是遗传惰性区。在细胞周期中表现为晚复制，早凝缩，即异固缩现(heteropycnosis)。原核细胞与真核细胞特征分析染色体特性：分子结构相对稳定能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性能够产生可遗传的变异真核细胞染色体的组成DNA 30%--40%组蛋(histone) 非组蛋(NHP) 变化很大少量RNA染色体中的蛋白质组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3及H4。非组蛋白(non-histoneprotein)：是染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，所以又称为序列特异性DNA结合蛋白。组蛋白具有如下特性：1、进化上的极端保守性。2、无组织特异性。3、肽链上氨基酸分布的不对称性。4、组蛋白的修饰作用。5、富含赖氨酸的组蛋白H5。非组蛋白：非组蛋白大约占组蛋白总量的60－70%，种类很多。HMG(highmobilitygroupprotein)，能与DNAH1作用,可能与DNA螺旋结构有关。DNADNAA24非组蛋白：与H2A非组蛋白的一般特性：1.非组蛋白的多样性；非组蛋白的量大约是组蛋白的60%～70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。2.非组蛋白的组织专一性和种属专一性。DNAC值：通常指一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象：真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开，这就是著名的“C值反常现象”。染色体中的DNA根据DNA的动力学研究，真核细胞DNA可分为：高度重复序列：几百→几万copy。如：卫星DNA和微卫星DNA。中度重复序列：10→几百copy。如：各种rDNA、tDNA及组蛋白基因。低度重复序列：2→10copy。如：血红蛋白。单拷贝序列：大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列。只有一个拷贝。如：蛋清蛋白。染色体折叠DNA核小体螺线管圆筒超螺旋核小体染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。核小体(nucleosome)：DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp)，形成核小体核心颗粒。螺线管10nm的染色质细丝盘绕成螺旋管状的30nm纤维粗丝，通称螺线管solenoi。螺线管的每一螺旋包含6个核小体，其压缩比为和分裂中期染色体的基本组分。上述螺线管可进一步压缩形成超螺旋。由30nm螺线管缠绕而成一细长、中空的圆筒，直径为440。超螺旋进一步压缩1/5便成为染色体单体，总压缩比是7×6×40×5，原核生物基因组特点：1、结构简练2、存在转录单元 多顺反子mRNA3、有重叠基因Sanger1977在《Nature》上发表了ΦX174DNA的全部核苷酸序列，正式发现了重叠基因。第二节DNA的结构一、DNA的一级结构所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。基本特点①DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤只能与胞嘧啶配对。2、DNA的二级结构DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。A-DNA和Z-DNA3、DNADNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。DNA分子的超螺旋化可以用一个数学公式来表示：L=T+W其中L为连接数linkingnumbe，是指环形DNALT为双螺旋的盘绕数twistingnumbe，W为超螺旋数writhingnumbe，它们是变量。2．3DNA的复制DNA复制的起点、方向和速度一、DNA1、DNA的半保留复制每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA的半保留复制semiconservativereplicatioDNA的这种半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性。2、复制的起点与方向一般把生物体的复制单位称为复制子replico。一个复制子只含一个复制起点。多复制子：DNA复制时，原核生物一般只有一个起始位点，而真核生物则有多个起始位点，因而在复制时呈现多复制泡，也称为多复制子。DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的（图2-1。复制叉以DNA顺序为起点，向两个方向等速生长前进。拓扑异构酶I拓扑异构酶IDnaDNA解链酶（DNAhelicase）DNA解链酶能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。单链结合蛋白（SSB蛋白）SSB蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。所以，SSB蛋白只保持单链的存在，并不能起解链的作用。3、DNA的半不连续复制与冈崎片段DNA复制时，短时间内合成的约1000个核苷酸左右的小片段，称之为冈崎片段(Okazakifragment)DNA制在生物界是有普遍性的，因而称之为双螺旋的半不连续复制。DNA链的延伸：DNA复制体(replisome)：在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和解链酶构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体。4、滞后链的引发DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3'端开始合成新的DNA链。滞后链的引发过程往往由引发体来完成。引发体由6种蛋白质nn'Dna、CI6进一步组装后形成引发体，才能发挥其功效。5、链的终止当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。6、复制的几种方式(1)环状DNA环状双链DNA的复制可分为θ型、滚环型和D-环型几种类型(a) θ型复制的起始点涉及到DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制叉。前导链DNA开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短RNA链，作为起始DNA复制的引物。(b) 滚环型（rollingcircle）这是单向复制的特殊方式。如ΦX174的双链环状DNADNA5‘端被从双链环中置换出来并为单链DNA3’—OHDNADNA（c）D-环型（D-loop）DNA（即D-环。（2）线性DNA双链的复制DNARNA5DNADNAT7DNA3DNA20DNADNA二、原核和真核生物DNA的复制特点1、原核生物DNA的复制特点大肠杆菌DNAIIIIII原核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ：有3’→5’外切酶活性和5’→3’外切酶活性。保证DNA复制的准确性。DNA聚合酶Ⅱ：活性低，其3’→5’核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修复DNA的作用。DNA聚合酶Ⅲ：7种亚单位9个亚基。只具3’→5’外切酶活性，主导聚合酶。KlenowfragmentDNA76000UKlenow3’→5’外切酶的活性，广泛使用于DNA三、真核生物DNA的复制特点真核生物DNA复制的起始需要起始原点识别复合物（ORC）参与。真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50bp秒，还不到大肠杆菌的120。真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始。真核生物DNADNA原核细胞DNA的复制调控：复制叉的多少决定了复制频率的高低。真核细胞DNA的复制调控：细胞生活周期水平调控染色体水平调控复制子水平调控真核和原核生物DNA复制的比较相同：半保留复制都有引发、延长、终止三个阶段都必须有相应功能的蛋白质和DNA聚合酶参与区别：真：多个复制起始点；原：一个复制起始点真：所有复制受一种调控；原：一个复制子上有多个复制叉DNADNA修复系统 功能错配修复 恢复错配碱基切除修复 切除突变的碱核苷酸切除修复 修复被破坏的DNADNA直接修复 修复嘧啶二体或甲基化DNADNA转座子的分类和结构特征转座作用的机制转座作用的遗传学效应真核生物中的转座子(Movablegene(Transposableelements)，是存在于染色体DNA(Jumping原核生物的转座因子可分为：(insertionsequence，IS)：最简单的