多糖结构分析

多糖结构研究方法多糖及其复合物是来自于高等动、植物细胞膜和微生物细胞壁中的天然大分子物质之一，自然界含量丰富，与人类生活紧密相关，对维持生命活动起至关重要的作用。多糖和核酸、蛋白质、脂类构成了最基本的4类生命物质。由于多糖的生物活性与多糖的结构关系密切，因此清楚认识多糖的结构是进行多糖研究和利用的基础。多糖结构比蛋白质和核酸的结构更加复杂，可以说是自然界中最复杂的生物大分子。从化学观点来看，多糖结构解析最大的难点就在于其结构的复杂性。糖的结构分类可沿用蛋白质和核酸的分类方法，即多糖的结构也可分为一级、二级、三级和四级结构。与蛋白质或核酸大分子相比，糖链的一级结构“含义”要十分丰富。测定糖链的一级结构，要解决以下几个问题：(1)相对分子质量；(2)糖链的糖基组成，各种单糖组成的摩尔比；(3)有无糖醛酸及具体的糖醛酸类型和比例；(4)各单糖残基的D-或L．构型，毗喃环或呋喃环形式；(5)各个单糖残基之间的连接顺序；(6)每个糖苷键所取的a-或B．异头异构形式；(7)每个糖残基上羟基被取代情况：(8)糖链和非糖部分连接情况；(9)主链和支链连接位点：（10)糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等。多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象，与分子主链的构象有关，不涉及侧链的空间排布；多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象四。多糖结构的分析手段很多。不仅有仪器分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有化学方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等。1质谱(MS)由于MS法在糖链结构分析中具有快速灵敏，样品用量少、结构信息直观的特点而得到越来越广泛的应用。近年来各种软电离技术的诞生，如快原子轰击质谱(FAB—MS)，电喷雾质谱(ESI—MS)，基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)等，使得糖结构分析的研究取得了日新月异的发展。(1)快原子轰击质谱(FAB—MS)FAB-MS是上世纪80年代初发展起来的一种新的软电离质谱技术。其显著区别于传统质谱之处在于样品受加速原子或离子的轰击，可直接在基质溶液中电离。FAB-MS的引入使传统质谱技术难以分析的极性强，难挥发以及热不稳定的化合物不经衍生化就可以直接进行质谱分析，而且对生物大分子的研究取得了重大突破。FAB-MS已被证明是分析糖结构最为有力的方法之一，它不仅可以测定寡糖及其衍生物的分子量，而且可以测定聚合度高于30的糖的分子量。同时，FAB-MS还可以确定糖链中糖残基的连接位点和序列，已广泛用于糖类的分析。(2)电喷雾质谱(ESI-MS)ESI-MS是将溶液中分子转变成气相离子非常有效的手段，是目前最软的一种电离方式。这种电离方式所产生的分子离子往往带有多电荷。因此ESI-MS可以测定的分子量范围大大扩展。对多糖而言，ESI-MS可以分析nh25个甚至更多单糖残基组成的含有羧基或硫酸根等官能团的多糖。近年来，ESI-MS已在多糖的结构分析中显示了强大的生命力。它能用于衍生化和非衍生化多糖的测定。ESI-MS易与HPLC，CE等技术联用，大大提高了工作效率以及灵敏度和精确度，如ESI-MS与I-IPLC联用分析寡糖及其衍生物。(3)基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)MALDI-MS于上世纪80年代末问世。由于技术的特点，这种离子化方式电离出的离子常用飞行时间(TOF)检测器检测，因此MALDI-MS常与TOF一起称为基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。它也是一种软电离方式，产生的分子离子十分稳定，不易裂解，所以适用于检测大分子质量的生物样品。2红外光谱(IR)红外光谱(infraredspectroscopy，IR)是一种吸收光谱。因为红外光只能激发分子内原子核之间的振动和转动能级的跃迁，所以红外吸收光谱是通过测定振动和转动能级跃迁的信息来研究分子结构的。在红外光谱图中，纵坐标一般用线性透光率作标度，称为透射光谱图；也有采用非线性吸光度为标度的，称为吸收光谱图。谱图中的横坐标是以红外辐射光的波数(锄d)为标度。较少采用波长(pm)为标度。波长和波数的关系依照式为：v(cml)×u岬)=104。红外辐射光的波数可分为近红外区(10000-4000cm-1)、中红外区(4000-400cm-1)和远红外区(400-10cnl-1)。其中最常用的是中红外区，大多数化合物的化学键振动能级的跃迁发生在这一区域，因此主要研究中红外区域的吸收光谱即分子的振动光谱，可以对各种高分子材料进行分析、测定。则对应这些基团的一些谱带在这个化合物的取光谱中往往是最强的，明显地显示这个基团的结构特征。因此，对应这些基团的谱带在其聚合物的谱图中，常常是处于最显著的地位，能够很特征地反映该类聚合物的结构和预示其存在。对于各种聚合物分子来说，含有的主要极性基团是酸、酯、酰胺、酰亚胺、苯醚、脂肪醚和醇等。除此之外，含有硅、硫、磷、氯和氟等杂原子的化合物也常具有较强的极性。红外光谱作为“分子的指纹”广泛用于分子结构和物质化学组成的研究。根据分子对红外光吸收后得到谱带频率的位置、强度、形状以及吸收谱带和温度、聚集状态等的关系便可确定分子的空间构型，求出化学键的力常数、键长和键角。从光谱分析的角度看主要是利用特征吸收谱带的频率推断分子中存在某一基团或键，由特征吸收谱带频率的变化推测临近的基团或键，进而确定分子的化学结构，当然也可由特征吸收谱带强度的改变对混合物及化合物进行定量分析。3拉曼光谱拉曼散射又称拉曼效应，是由印度物理学家拉曼于1928年首先发现并因此获得1930年诺贝尔物-理奖。拉曼效应是能量为hvo的光子同分子碰撞所产生的光散射效应，也就是说，拉曼光谱是一种散射光谱。单色光束的入射光光子与分子相互作用时可发生弹性碰撞和非弹性碰撞，在非弹性碰撞过程中，光子与分子可以直接进行观察，所以不会由于制样原因而产生假象。这对断口的失效分析特别重要。样品制备简单，可以是自然面、断口、块状、粉体、反光及透光光片，对不导电的样品只需蒸镀一层20nm的导电膜。另外，现在许多SEM具有图像处理和图像分析功能。有的SEM加入附件后，能进行加热、冷却、拉伸及弯曲等动态过程的观察。但扫描电镜只能观察物质表面的微观形貌，无法获得物质内部的信息。7透射电子显微镜透射电子显微镜是以波长很短的电子束做照明源，用电磁透镜聚焦成像的一种具有高分辨本领，高放大倍数的电子光学仪器。测试的样品要求厚度极薄(几十纳米)，以便使电子束透过样品。在真空条件下，电子束经高压加速后，穿透样品时形成散射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。投射电子显微镜结构如图1．2所示[91。透射电子显微术在高分子研究中有着重要的应用。它可用来观察高分子晶体的形貌和结晶结构，高分子多相体系的微观相分离结构，高分子材料的网络，测定高分子的分子量分布和多孔高分子薄膜的微孔大小与分布，高分子材料的表面、界面和断口、粘合剂的粘结效果以及聚合物涂料的成膜特性，还可用来使高分子晶体的晶格至高分子本身直接成像。透射电镜由于入射电子透射试样后，将与试样内部原子发生相互作用，从而改变其能量及运动方向。显然，不同结构有不同的相互作用。这样，就可以根据透射电子图象所获得的信息来了解试样内部的结构。由于试样结构和相互作用的复杂性，因此所获得的图象也很复杂。它不象表面形貌那样直观、易懂。8差示扫描量热法(DSC)DSC是在程序控制温度条件下，测量输入给样品与参比物的功率差与温度关系的一种热分析方法。差示扫描量热法又称为差动分析，有功率补偿式差示扫描量热法和热流式差示扫描量热法两种类型。典型的差示扫描量热(DSC)曲线以热流率(dH／dt)为纵坐标、以时间(t)或温度(T)为横坐标，即dH／dt．t(或T)曲线。曲线离开基线的位移即代表样品吸热或放热的速率(mJ·s‘1)，而曲线中峰或谷包围的面积即代表热量的变化。因而差示扫描量热法可以直接测量样品在发生物理或化学变化时的热效应。能定量测定多种热力学和动力学参数，如比热、反应热、转变热、反应速度和高聚物结晶度等。9圆二色谱(cD)法一束平面偏振光可以看成是相同频率和振幅的左、右圆偏振光的迭加，当这两束偏振光通过光活性介质时，如果它们的波长在该光活性的生色团的吸收范围内，由于光吸收的不同，透射后的两束光的振幅有不同的减少，这样透射光的迭加就形成了一个椭圆偏振，这种现象称为圆二色性，通过记录不同波长处所对应的椭圆率就得到圆二色谱(CD)t10l。圆二色光谱仪的结构(如图1