苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定

苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定一、 目的掌握纯化酶的基本操作和方法；学习一种常用的酶活力测定法。二、 原理苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine:ammonialyase,简称PAL；EC4.3.1.5)是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若酶的加入量适当，A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。规定1h内A290增加0.Ol为PAL的一个活力单位。三、 试剂和材料0.lmol硼酸一硼砂缓冲液(pH8.7)酶提取液0.1mol/I硼酸一硼砂缓冲液(含1mmol/I,EDTA,20mmol/LP一巯基乙醇)0.6m.ol/I-L一苯丙氨酸溶液(4)6mol/lHCl固体硫酸铵0.02mol/l-磷酸盐缓冲液(pH8.0,含0.5mmol/LEDTA,2.5%甘油，20nlmol/l.p-巯基乙醇)(7)SephadexG一25(8)DEAE纤维素52(9)标准蛋白质溶液(100ug/ml):准确称取IOmg牛血清自蛋自于烧杯内，用蒸馏水溶解，完全转移到100ml容量瓶内，定容至刻度，混匀。(10)考马斯亮蓝G-250蛋白质染色液：称取10mg考马斯亮蓝G-250,溶于5ml95'%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸loml，混匀后即为母液。用时，按15ml母液加85m1蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液。(11)滴管(l2)止水夹材料：供试植物材料四、操作步骤(1)酶液提取植物材料lg，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上研钵研磨。将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管，10000g冷冻离心30分钟。取离心后的上清液(酶粗提液)，量出其体积，放置冰浴中备用。(4)硫酸铵分级沉淀酶蛋白从酶粗提液中吸出0.5m1，以作后面活力测定用。余下酶液根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min;然后于10000g下冷冻离心l0min，保留上清液于烧杯内。根据硫酸安饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。按上述同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶于1ml酶抽提液中。（5）SephadexG一25层析脱盐凝胶溶胀：称取SephadexG一255g,加入适量0.02mol/I.磷酸盐缓冲液，在室温下溶胀。待溶胀平衡后，虹吸去除上清液中的细小凝胶颗粒，这样处理2—3次。装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，将20m1蒸馏水装入柱内，打开止水夹赶去出口内气泡，当柱内保留1ml左右水层时，把处理好的SephadexG25用玻璃棒搅匀，尽量一次加入柱内，待胶床表面仅有1-2cm液层时，旋紧止水夹、。装好的胶柱应无气泡、无节痕、床面平正，床面铺1张圆形滤纸片。上样：让胶床表面几乎不留液层，将lml酶液小心注入胶床而中央，注意不要冲坏床面，吸取lm!磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在床表面仅有lml左右液层时，再小心地用滴管加入5-6cm高的磷酸缓冲液洗脱。洗脱收集：取刻度试管5支（包括上面一支），编号，柱床上面不断加磷酸盐缓冲液洗脱，出水口不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集3m1。测定每管的PAL酶活力，合并PAL活力高的试管，记为酶洗脱液。（6）DEAL纤维素柱梯度洗脱称取DEAE纤维素52干粉1一1.5g，加20m1的0.02mol/I.磷酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱（方法及要求同凝胶层析柱）。装柱完成后，用2一3个床体积的0.02mol/I_磷酸盐缓冲液（PH8.0）平衡该柱。上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，所有注意点和方法也与凝胶层析中上样相似。上样结束后，在床面以上小心地加入0.02niol/I_磷酸盐缓冲液2-3cm厚液层。注意上样开始就收集流出液。洗柱：约用2倍床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液洗柱，收集洗柱液。按洗脱管编号，每隔3管（如1,4,7等）取其洗脱液0.1m1，测各管中PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其总体积（ml）。（7）酶活力测定取试管3支，按表中所述加样（0号为调零管，1号为测定管，2号为对照管）试管编号1230.01mol/l硼酸缓冲液43.94.9酶液0.10.10.6mmol/l苯内氨酸(ml)11将各管混匀，放入40度恒温水浴保温1h，到时加0.2ml2mmol/1.HCl终止反应。紫外分光光度计预热lOmin,于波长290nm处测定各管的A290。（8）蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）取酶液0.Iml，用蒸馏水稀释至5ml.取试管8支，按下表加入各溶液：试管编号01234567标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81.0稀释酶液（mI）11蒸馏水（ml）21.81.61.41.21考马斯亮蓝（ml）22222222将上述各管混匀，静置2min,测定各管的A595,五、结果处理PAL总活力、比活力、蛋自质含量的计算步骤体积（ml）蛋白质含量（mg）总活力（m）比活力(m/mgprotein)粗提硫酸铵沉淀凝胶层析离子交换层析注：（1）绘制蛋白质测定的标准曲线：以1~5号管溶液的A595值为纵坐标，相应管中的蛋自质微克数为横坐标，作图。（2）PAL比活力计算：a六、注意事项1.往酶液中加固体硫酸铵时，注意不能有大颗粒，加的速度也不能过快。2.层析柱要保持与地面垂直，往柱内加样品时要小心，避免冲坏床面。七、思考事项1.在PA