利用实时定量-PCR技术通过-△△CT-方法分析相对基因表达差异优质资料

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利用实时定量PCR技术通过2-△△CT方法分析相对基因表达差异利用实时定量PCR技术通过-△△CT方法分析相对基因表达差异优质资料(可以直接使用，可编辑优质资料，欢迎下载）KennethJ.LivakandThomasD.SchmittgenDepartmentofPharmaceuticalSciences,CollegeofPharmacy.WashingtonStateUniversity,Washington99164-6534现在最常用的两种分析实时定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2-△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR定量PCR相对定量实时PCRTaqman反转录PCR（RT-PCR）是基因表达定量非常有用的一种方法（1－3）。实时PCR技术和RT-PCR的结合产生了反转录定量PCR技术（4，5）。实时定量PCR的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时PCR进行绝对定量已有多篇报道（6－9），包括已发表的两篇研究论文（10，11）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。用实时PCR对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2-△△CT方法可用于定量PCR实验来计算基因表达的相对变化：2-△△CT公式的推导,以及实验设计，有效性评估在AppliedBiosystemsUserBulletinNo.2(P/N4303859)中有介绍。用2-△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道(5,6)。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2-△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR数据分析中都可能被用到。•

2-△△CT方法•

2-△△CT方法的推导PCR指数扩增的公式是：Xn是第n个循环后目标分子数。X0是初始目标分子数。Ex是目标分子扩增效率。n是循环数CT代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数因此：XT是目标分子达到设定的阈值时的分子数。CT,X是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx是一个常数对于内参反应而言，也有同样的公式：用XT除以RT得到：对于使用Taqman探针的实时扩增而言，XT和RT的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K并不一定等于1。假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或：XN代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CT,X-CT,R）整理上式得：最后用任一样本q的XN除以参照因子（calibrator，cb）的XN得到：在这里对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：1.2方法的假设和应用要使△△CT计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释后扩增产物△CT如何变化。图1显示的是cDNA样品在100倍稀释范围内的实验结果。对于每一个稀释样本，都用GAPDH和c-myc特异的荧光探针及引物进行扩增。计算出c-myc和GAPDH的平均CT值以及△CT值，通过cDNA浓度梯度的log值对△CT值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于0，说明目标基因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过△△CT方法进行相对定量。在图1中，直线斜率是0.047，因而假设成立，△△CT方法可以用来分析数据。如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序列具有相同的扩增效率。1.3内标和参照因子的选择使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的RNA进行均一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时PCR反应内标基因包括GAPDH，β-actin,β2-microglobulin以及rRNA。当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。验证实验处理是否对内标基因表达产生影响的方法在2.2部分有描述。方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator）。经内标基因均一化处理后，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照样，△△CT＝0，而20＝1。所以根据定义，未处理样本的倍数变化为1。而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0时刻的样本作为参照因子。有些情况下，并不是比较不同处理样本基因表达差异。例如，有的是想看某一器官中特定mRNA的表达。在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该mRNA的表达。表1显示了大脑和肾脏总RNA中c-myc和GAPDH转录本的CT值。在这一个例子中，大脑被人为的选择为参照因子，通过计算得到肾脏c-myc表达量经GAPDH校正后相对于大脑的表达量的结果。尽管相对定量方法可用于这种组织之间的比较，但结果的生物学解释是相当复杂的。不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织中都存在。

1.4方法的数据分析实时定量PCR所得到CT值可以很容易的输出到表格程序如MicrosoftExcel中去。为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。通过β-actin均一化处理，我们对目标基因fos-glo-myc的表达变化进行了监测。在8h的时间范围内，在每一时间点都取3个重复样本，每一样本在cDNA合成之后都做定量PCR，数据分析用到了公式9，即：Timex表示任意时间点，Time0表示经β-actin校正后1倍量的目标基因表达。0时刻目标基因和内标基因的平均CT（见图2第8栏）被用于公式9中。通过公式9计算出每一个样本目标基因表达通过β-actin均一化处理后相对于0时刻的倍数（见图2第9栏）。平均SD，CV由每一个时间点所取的三个重复样求得。用这种分析方法，在0时刻的平均倍数变化接近于1。我们发现通过检测在0时刻平均倍数变化是否为1可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。如果得到的结果与1偏差很大,则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的RNA样本进行了分析。因此对每一个样本分别处理，通过计算后取结果的平均值就非常重要。如果是同一样本进行PCR扩增的重复，这就需要首先求出平均CT,然后再进行计算。怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。表1给出了目标基因（c-myc）和内参基因（GAPDH）在不同管中扩增的实验数据。在这里不应该把任一单个的c-myc管子和GAPDH管子作比较，而应该分别计算出c-myc和GAPDH的平均CT来计算△CT。重复实验中CT值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最后结果中相对量的变化。但其中的一个难点是CT值与相应的拷贝数成指数关系（见第4部分）,因此，在最后的计算中，的误差通过△△CT加上标准偏差和△△CT减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。不对称分布是因为结果经指数处理后转化成量的线性比较造成的。通过不同荧光染料标记的探针，我们可以在同一管中同时扩增目标序列和内标序列。表2给出了目标基因（c-myc）和内标基因（GAPDH）在同一管中扩增的实验数据。对于任意一个管子，目标基因（c-myc）和内参基因（GAPDH）扩增时加入的cDNA量都是一样多的，所以可以分别对每个管子计算△CT值，这些值取平均后再进行计算。在这里估计误差值也是一个不对称的范围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。在表1和表2中，估计误差在从△CT到△△CT的计算中未见有增加，这是因为我们把参照基因和检测基因的误差都显示出来了。我们把△CT,cb当作一个人为设定的常数来减去，得到△△CT。这样得到的结果就与图2所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的CT值求所得结果相当。另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的１倍的量，在这种情况下，平均△CT,cb的误差值被引入到每一样本的△△CT中。在表１中，肾脏中△△CT变成－2.50±0.20而经过校正的c-myc量是5.6倍，范围从4.9到5.6。而在大脑中的结果是没有误差的１倍。2.2-ΔCT’方法2.12-△CT’方法的推导通过内标RNA可以对加入RNA的量的差异进行校正。方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时PCR实验的一部分数据来完成这种校正。在其它的方法不能定量初始RNA量的时候：例如，在能得到的RNA量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候，这一方法的优势就格外明显。当然我们也可以利用PCR实验以外的方法来完成这种校正。最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于cDNA合成的RNA量，然后将相同的RNA反转录产生的cDNA用于PCR定量反应。这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。在这里，目标基因和内标合二为一。在这个例子中，公式[2]不被公式[3]除，公式［5］变成：整理得：任一样品Ｘ0,q除以参照品X0,cb得：在这里△CT’=CT,q-CT,cb。△CT’与前面计算中用的△CT（用目标基因CT值减去参照基因CT值）相互区别。就象在1.1部分所描述的，如果条件优化较好，效率接近于1，内标相对于参照因子为：2.22-△CT’方法的应用2-△CT，方法的一个应用就是确定实验处理对某一候选内标基因的影响。为了显示这一过程，我们做了血清饥饿/诱导实验(7)。血清饥饿/诱导是研究某些mRNA降解的常用方法(8)。然而，血清可能影响一些基因的表达包括标准的看家基因的表达。在24-h血清饥饿培养之后，在NIH3T3细胞中加入15%血清诱导基因表达。从细胞中提取Poly(A)+RNA，并将之反转录成cDNA。利用SYBRGreen通过实时定量PCR检测GAPDH，β2-microglobulincDNA的量。GAPDH和β2-microglobulin各自的相对量通过2-△CT‘公式求得。细胞处理对于GAPDH的基因表达有明显影响，但对β2-microglobulin没有什么影响。因此β2-microglobulin很适合做血清刺激定量实验的内标，而GAPDH并不适合。这一例子向大家展示了在只研究一个基因的时候怎么用2-△CT‘的方法分析基因相对表达数据。3.实时PCR数据的统计学分析实时PCR最终分析的是阈值循环或C。CT值通过PCR信号的对数值和循环数来确定。因此CT值是一个指数而非线性概念。因此，在任何统计分析中都不要用原始的CT值来表示结果。正如我们在前文中所描述的一样，PCR相对量通常和内标和参照样本一起计算而很少直接用CT值来表示，除非我们想检验重复样本之间的差别。为了向大家显示这一点，我们用SYBRGreen通过real-timePCR来检测相同cDNA的96个重复反应。所有反应组分在同一管中混好后分装到96个管中，做实时PCR分析，得到了每一个样本的CT值。为了比较样品间变化，计算了96个样本的平均±SD，如果通过原始CT值计算，平均±SD是20.00±0.193，CV为0.971%。但是如果把原始Ct值用2-CT转化成线性形式，平均±SD是9.08×10-7±1.33×10-7，CV为13.5％。从这个简单的例子我们可以看出，通过原始CT值来反映变化是错误的，应该避免。用2-CT将单个数据转化成线性形式来说明重复样本之间的变化和差异更准确可靠。结论：实时定量PCR实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，研究人员在设计实时定量PCR实验分析基因表达的时候首先要问的一个问题就是：数据最后会以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。本文所给出的公式对于每个用相对定量的方法分析基因表达差异的研究人员都足够了。下面，我们总结一下实验设计和评估中的一些重要步骤：•

选择一个内标基因。•

确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。•

通过PCR扩增目标基因和内标基因RNA或cDNA的一系列梯度稀释模板确保它们的扩增效率相同。最后通过2-△CT计算将统计数据转化成线性形式而不是原始CT值。基因频率和基因型频率的计算基因频率和基因型频率的计算（一）。根据基因型或基因型频率计算基因频率：例1。从某个种群中随机抽出１00个个体，测知基因型为AA，Aa和aa的个体分别是30、60和10个，求ａ的基因频率。解析：可以通过基因型频率计算基因频率。一对等位基因中的一个基因的频率：基因频率(Ａ)=对应纯合子(AＡ）基因型频率＋杂合子（Aａ）基因型频率的1/２。１00个个体中ＡA为３0个,Aa为６０个，ａa为10个，则AA这种基因型的频率为30÷100=30％；同理，Aa为60％,aa为１0%,则A基因的基因频率为30％+60％×1／２=60％,ａ基因的基因频率为10％＋60％×1／2=４0％。答案:A基因的基因频率为６0％，a基因的基因频率为40％。变式训练1．已知人眼的褐色（A）对蓝色（a)是显性，属常染色体上基因控制的遗传。在一个300０0人的人群中，蓝眼的有3６0０人，褐眼的有26400人,其中纯合子有12000人，那么，这一人群中A和a基因的基因频率分别为—-——--－－———-—--——－—-－—-——－——--—-（）Ａ．64%和36％B.3６%和64％C．５0%和５0％Ｄ．８2％和1８%（二）.在伴性遗传中有关基因频率的相关计算：﹡例２.若在果蝇种群中,XB的基因频率为９0％，Xb的基因频率为1０％，雌雄果蝇数相等，理论上ＸbXb、XｂY的基因型比例依次为--－－-——----—-——-－－-－——--－-－－-－-—---—-－--－——-()Ａ.1％、2％B.0。５％、５％C。１0％、10％D．5%、0．5%解析：由于在该果蝇种群中，雌雄果蝇数相等,所以雌果蝇产生的配子中，XB的基因频率应为9０％,Xｂ的基因频率为10%。雄果蝇产生的配子中,有约1/2的含Y染色体的配子，另有约1/2的含X染色体的配子,在含Ｘ染色体的雄配子中，ＸＢ与Xb的基因频率也分别为９0％和１0%。它们配子的结合情况可从下表中得出:雄配子雌配子Y（1/２)XＢ（1/2）×９０%Xb(１／2）×10%ＸB90％XBY45%XBXB4０．５％XBXb4．５％Xｂ10％XbY５％XBＸb4.5％XｂXｂ0．5％可见,理论上XBＹ基因型比例为45％，XbY的为5％，ＸBXb的为9%，XｂXb的为０.5％。答案：B。变式训练2．对某校学生进行红绿色盲遗传病调查研究后发现：78０名女生中有患者23人，携带者52人，820名男生中有患者6５人,那么该群体中红绿色盲基因的频率是-—－--－()A。４。4％Ｂ。５.１％C.6.８%D。10．2％（三)．利用遗传平衡定律求解基因频率和基因型频率1.对遗传平衡的理解：遗传平衡指在一个极大的随机交配的种群中，在没有突变发生,没有自然选择和迁移的条件下，种群的基因频率和基因型频率在一代一代的遗传中可以世代保持不变。在遗传平衡的种群中，某一基因位点上各种不同的基因频率之和以及各种基因型频率之和都等于是1。２．遗传平衡定律公式的推导和应用在一个遗传平衡的自然种群中,一个位于常染色体上的显性基因A的基因频率为p,与其相对应的隐性基因a的频率为q,则该种群的后代中ＡA、Aａ、aａ的基因型频率各是多少？三种基因型频率之和为多少?分析：依题意，在一个遗传平衡的自然种群中,显性基因A的基因频率与隐性基因a的基因频率之和（p+q）应等于1，其雌雄个体向后代传递基因A型配子的频率为ｐ，与其相对应的传递隐性基因ａ型配子的频率为q,则可用下表表示各类配子的组合类型、子代基因型及其出现的概率:雄配子雌配子Ａ（p)a（q）A（p)ＡA（p２)Aa（pq）a（q）Aa（pｑ）Aa(q2）可以得出该种群后代中出现三种基因型AA、Aa、aa，并且三种基因型出现的频率分别为ｐ2、2ｐｑ、q2，且它们的频率之和为p2+２pｑ＋q2=(p+q)2=1。又因为该种群是一个处于遗传平衡的自然种群,所以其种群特征应与此一致。这样学生就很容易理解遗传平衡定律了。例3．囊性纤维变性是一种常染色体遗传病。据统计，在某欧洲人群中，每２500个人中就有一个患此病.现有一对健康的夫妇生了一个患有此病的孩子，此后,该妇女又与健康的男子再婚.则该再婚的双亲生一孩子患该病的概率是多少——-—－—--———－-－———－——--－(）A．1／2５B.１/５０Ｃ.1/100Ｄ．1/６25解析：由于双亲正常,却生一病孩，可推知囊性纤维变性属于常染色体隐性遗传病,如把其控制基因记作a，则该妇女的基因型为Ａａ，这个妇女（Aa)与另一健康男子结婚,如若也生一病孩,则此健康男子必须是杂舍子（A)才有可能,所以解答本题的关键就在于求出该健康男子是杂合子的概率。根据题意，如果设基因ａ的频率为ｑ，则有基因型aa的频率=q×q=1／2500,可得q=1/50,基因A的频率p=１一ｑ＝４9/５0.这样杂合子Aa的基因型频率=2pq＝２×49／５0×1／50≈１/25,又考虑到双亲均为杂合子时后代出现隐性纯合子aa的可能性是1／4，由此可算出再生一孩患病的可能性为1／2５×１／4＝1／１0０.答案：C。变式训练3．已知苯丙酮尿症是位于常染色体上的隐性遗传病。据调查，该病的发病率大约为1/１00００，请问在人群中该丙苯酮尿症隐性致病基因（ａ）的基因频率以及携带此隐性基因的携带者（Aa)基因型频率分别是-———－－-－—————--－－－－—－-—-——--—--—-－—--—--（）A．１％和0。９９%B．１%和１。98%C。1%和3。9６％D．1%和０。198%例4.玉米的黄粒(Ｒ)对白粒(r）是显性。现将纯合的黄色玉米和白色玉米交杂，得Ｆl全是黄色，F1的黄色玉米自交得F2。让F２代的黄粒玉米之间随机交配，则其子代F３中黄粒与白粒玉米的比为：Ａ．1:1B．2:1Ｃ．3：1D.8:１解析：解此题用基因频率的方法计算就简单多了。在F2的黄粒玉米中，基因型RR占1／3，Rｒ占２／３,所以在群体中产生的雌配子基因型有二种即Ｒ和r，其中含基因R的配子比例为2/３，含基因ｒ的配子比例为1/3；雄配子中含基因R的配子比例为２／3，含基因ｒ的配子比例为1／３。由于F２代的黄粒玉米之间随机交配，雌雄配子的结合是随机的，可以用下表表示：黄粒F２的配子雌配子R（2／3)雌配子ｒ（1／3)雄配子R(2／3)RＲ（4／９)Rr（2／9）雄配子r（１/３）Rr(2/9）rr（1／9）从上表可得出子代F3的表现型及比例为:黄粒(ＲR，Ｒr)8／9,白粒（rr）1／9。答案：Ｄ。变式训练4.某豌豆基因型为Dd，让其连续两代自花授粉后，进行人工随机授粉，则随机授粉后的子代中dd占的比例为-－---－-—－——-－－—－－—－－--———－-－—－———--————-—--——（)A.１/4B.1/9C．9/６4D.６／6４三．反馈训练:１.（２007年江苏高考第15题）果蝇的体色由常染色体上一对等位基因控制，基因型BB、Bb为灰身,bb为黑身。若人为地组成一个群体，其中80％为BＢ的个体,20％为ｂb的个体，群体随机交配,其子代中Ｂｂ的比例是A。２5％Ｂ.３2％C．50％D．64%2.如果在一个种群中，基因型AA的比例占25％，基因型Aa的比例占50％,基因型ａａ的比例占2５%。已知基因型aａ的个体失去求偶繁殖能力,则随机交配一代后，子代中基因型aａ的个体所占的比例为－—－—-－———－—-－－-———－-－——-—--—--—－----———-－-－－－-—-——－-－－（）A。1/16Ｂ.1/8C．１／9D．３。假设某中心血防站调查了1７８8个MN血型血样本，其中397人是M型（LMLM）,86１人是MN型(ＬMＬＮ),５30人是N（ＬＮＬＮ）型，则LＭ和LN的基因频率分别是—--－————---－－()A．43．７%、56．3%B.56．3％、43。7%C。５3。7％、46。3%D．４6。3％、53.7％4.（２007年广东高考第2０题）某常染色体隐性遗传病在人群中的发病率为１%，色盲在男性中的发病率为７％。现有一对表现正常的夫妇,妻子为该常染色体遗传病致病基因和色盲致病基因携带者。那么他们所生小孩同时患上述两种遗传病的概率是A。1/88B。１/22C5．经调查统计某地区人群中蓝眼(aａ）1600人，纯合褐眼（ＡA)1４０0人,杂合褐眼（Aａ）7000人,那么该地区人群中蓝眼基因和褐眼基因的基因频率分别是-—－———－--－———－—-－－(）Ａ。51％和49％ﻩﻩB．４３％和5７％C．32％和68％ﻩ ﻩD.２8%和７2%6.(2００7年唐山二模)某植物种群,ＡA基因型个体占30%，aa基因型个体占20％，则:(1）植物的A、a基因频率分别是、。（２）若该植物自交,后代中AA、ａa基因型个体分别占、。这时，A、a的基因频率分别是。(3）依据现代生物进化理论，这种植物在两年中是否发生了进化？,原因是。（4）由此可知，生物进化的基本单位是,进化的原材料由提供，是否发生进化决定于，进化的实质是。参考答案:变式训练:１.A２．C3.B4．A反馈训练：１。Ｂ2。C３。D4．A5.A6．（1）５5%、45%（2）42.5%32.5%５5％、45％（３)没有发生进化基因频率没有发生改变（4）种群突变和基因重组自然选择种群基因频率的改变作者简介：左延柏,男，中学高级教师,中国教育工作者协会会员，江苏省南京市高三生物教学研究核心小组成员.地址：江苏省南京市大桥南路16号邮编：２１０015电话：Emａｉl：zｙb210０15＠16３。coｍ«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《一般土石方工程作业指导书》施工作业指导书编号TSFGC-01具体内容:适用范围:一般土石方工程作业指导书满足要求.编写依据:一般土石方工程作业指导书满足要求.作业流程图:一般土石方工程作业指导书满足要求.安全风险辨析与预控:表4.1作业任务安全基准风险指南中的第12、13、16项与现场实际不符，本工程不需要风镐机，基坑内无岩石，以及没有用到打夯机夯实。作业准备：作业前施工条件以及人员、主要工具器和仪器仪表配置均与作业指导书所列相符。作业方法：一般土石方工程作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:一般土石方工程作业指导书满足要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《电缆管道作业指导书》施工作业指导书编号DLTJ-02具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:表4.1作业任务安全基准风险指南中的第10、17项与现场实际不符，本工程不需要风镐机，起重作业没有用到起重机。作业准备：作业前施工条件以及人员、主要工具器和仪器仪表配置均与作业指导书所列相符。作业方法：本工程作业方法与作业指导书中的作业方法第7项不符，工程没有采用支撑墩的作业方法，其他项作业方法与书中所列一致。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《电缆井作业指导书》施工作业指导书编号DLTJ-03具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:表4.1作业任务安全基准风险指南中的第17、20项与现场实际不符，本工程不需要用到砂浆搅拌机以及打夯机。作业准备：作业前施工条件以及人员、主要工具器和仪器仪表配置均与作业指导书所列相符。作业方法：本工程作业方法与作业指导书中的作业方法第7项不符，工程没有采用圈梁混凝土浇筑的作业方法，其他项作业方法与书中所列一致。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《电缆支架作业指导书》施工作业指导书编号PWDK-01具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:表4.1作业任务安全基准风险指南中的第2、3、5项与现场实际不符，本工程为室内电缆沟支架安装。作业准备：作业前施工条件以及人员、主要工具器和仪器仪表配置均与作业指导书所列相符。作业方法：作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《电缆敷设作业指导书》施工作业指导书编号DLFS-01具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:作业指导书满足施工要求。作业准备：施工现场与作业指导书中的表5.1中第6项所提电缆桥架内容不适用，表5.2中第3项施工船、牵引机、埋设机、高压水泵等不适用，其他内容均相符。作业方法：作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《电力电缆试验作业指导书》施工作业指导书编号DQSY-07具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:作业指导书满足施工要求。作业准备：作业指导书满足施工要求。作业方法：作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《冷缩电缆中间接头制作安装作业指导书》施工作业指导书编号DLFJAZ-03具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:现场实际与表4.1中第6、7项不符，本工程没有隧道。作业准备：作业指导书满足施工要求。作业方法：作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《冷缩电缆终端接头制作安装作业指导书》施工作业指导书编号DLFJAZ-01具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:作业指导书满足施工要求。作业准备：作业指导书满足施工要求。作业方法：作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《电缆防火封堵作业指导书》施工作业指导书编号DLFHFD-01具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:施工现场与表4.1中第1、2项不符，本工程没有隧道。作业准备：作业指导书满足施工要求。作业方法：作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《电缆终端头接地及保护管安装作业指导书》施工作业指导书编号DLFJAZ-05具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:作业指导书满足施工要求。作业准备：作业指导书满足施工要求。作业方法：作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《户外隔离开关安装作业指导书》施工作业指导书编号HWDQSB-02具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书满足施工要求.安全风险辨析与预控:作业指导书满足施工要求。作业准备：作业指导书满足施工要求。作业方法：作业指导书满足施工要求。质量控制措施及检验标准:作业指导书满足施工要求.«施工作业指导书» 差异化分析表施工作业指导书名称《接地工程作业指导书》施工作业指导书编号JDGC-01具体内容:适用范围:作业指导书满足施工要求.编写依据:作业指导书满足施工要求.作业流程图:作业指导书