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生物制品分析第二十章主要内容生物制品的质量要求鉴别试验生物制品检查内容4123生物制品的分类生物制品质量控制实例5学习要求掌握

分类、质量控制特点和要求鉴别方法、质量检查主要内容质量控制的主要手段熟悉了解生物制品生物制品生物制品定义：是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的制品。ChP2010凡例生物制品的分类预防类：疫苗治疗类：抗毒素及免疫血清、血液制品、细胞因子、DNA重组制品、单克隆抗体诊断类：体内诊断、体外诊断疫苗类药物用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成。分为细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗、双价疫苗和多价疫苗等。疫苗类药物细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗多价疫苗疫苗类药物细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗多价疫苗疫苗类药物细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗多价疫苗疫苗类药物细菌类疫苗病毒类疫苗联合疫苗多价疫苗抗毒素及抗血清类药物凡用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大动物所取得的免疫血清叫抗毒素（或抗毒血清）。凡用细菌或病毒本身免疫马或其他大动物所取得的免疫血清叫抗菌或抗病毒血清。抗菌或抗病毒血清抗毒素（抗毒血清）抗毒素及抗血清类药物血液制品

由健康人的血液或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分。重组DNA制品重组DNA制品系采用遗传修饰，将所需制品的编码DNA通过一种质粒或病毒载体，引入适宜的微生物或细胞系，DNA经过表达和翻译后成为蛋白质，再经提取和纯化而回收所需制品而得。重组激素类重组细胞因子类重组生长因子类单克隆抗体重组疫苗重组DNA制品诊断制品使用安全副作用小使用后产生相应效力相关各环节是可接受的安全性有效性可接受性生物制品的质量要求鉴别试验免疫双扩散法免疫电泳法免疫印迹法免疫斑点法酶联免疫法鉴别试验---免疫双扩散法基本原理：抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，叫做免疫扩散反应。将抗原与其相应抗体放在凝胶（如琼脂）平板中的邻近孔内，使它们互相扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即出现乳白色的沉淀线，称为双向免疫扩散试验。

鉴别试验---免疫双扩散法鉴别试验---免疫双扩散法鉴别试验---免疫双扩散法鉴别试验---免疫双扩散法鉴别试验---免疫双扩散法鉴别试验---免疫双扩散法鉴别试验---免疫电泳法

系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双向免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和性状进行比较，即可分析供试品中的成分及其性质。人血白蛋白、冻干人免疫球蛋白鉴别试验---免疫电泳法鉴别试验---免疫印迹法

系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。重组人促红素注射液（CHO细胞）、注射用重组人干扰素1b鉴别试验---免疫印迹法

鉴别试验---免疫斑点法注射用重组人干扰素2a等鉴别试验---酶联免疫法冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）、人用狂犬疫苗（Vero细胞）和重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）等。生物制品检查内容安全性效力检定毒性试验防腐剂试验热原质试验有关安全性的特殊试验浓度测定活菌率或病毒滴度测定动物保护率试验免疫抗体滴度测定稳定性试验生物制品检查内容（一）物理性状的检查外观真空度及溶解速率装量生物制品检查内容（二）蛋白质含量测定凯氏定氮法：在生物样品中，蛋白质含氮量相对恒定(16%)，即1克氮相当于6.25克蛋白质。

双缩脲法：蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu2+作用产生紫红色络合物（双缩脲反应），在一定范围内，颜色反应强度与蛋白质含量成正比。

酚试剂法：在碱性溶液中，蛋白质可与Cu2+螯合形成复合物，此复合物中酪氨酸和色氨酸残基使酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）还原，产生蓝色化合物。生物制品检查内容（三）防腐剂和灭活剂含量测定苯酚、甲醛、氯仿、汞制剂等（四）纯度检查（五）相对分子质量或分子大小测定（六）其他检查对象

菌毒种和主要原材料半成品成品生物制品检查内容（七）安全检查检查内容

过敏物质的检查杀菌、灭活和脱毒检查残余毒力和毒性物质的检查外源性污染的检查菌毒种和主要原材料半成品成品生物制品检查内容（七）安全检查：检查对象进行毒力、特异性、培养特性等试验菌毒种和主要原材料半成品成品生物制品检查内容（七）安全检查：检查对象是否有杂菌、有害物质的污染灭活剂、防腐剂是否过量等菌毒种和主要原材料半成品成品生物制品检查内容（七）安全检查：检查对象无菌检查、纯菌检查、毒性试验、热源试验、安全试验等等过敏性物质杀菌、灭活、脱毒残余毒力和毒性物质外源性污染生物制品检查内容（七）安全检查：过敏性试验牛血清含量测定血型物质检测过敏性物质杀菌、灭活、脱毒残余毒力和毒性物质外源性污染生物制品检查内容（七）安全检查：无菌试验活毒检查解毒试验过敏性物质杀菌、灭活、脱毒残余毒力和毒性物质外源性污染生物制品检查内容（七）安全检查：残余毒力检查无毒性检查毒性检查防腐剂检查过敏性物质杀菌、灭活、脱毒残余毒力和毒性物质外源性污染生物制品检查内容（七）安全检查：野毒检查热源试验乙型肝炎表面抗原生物制品检查内容血清学试验活菌数和活病毒滴度测定（八）生物制品的效力测定

免疫力试验定量免疫定量攻击法变量免疫定量攻击法定量免疫变量攻击法被动保护力测定一般杂质检查：特殊杂质检查：生物制品检查内容（九）杂质检查生物污染物：微生物、宿主蛋白、外源DNA、培养基成分等；产品相关杂质：多聚体、二硫化物异构体、突变产物等；工艺添加剂：抗生素、甲醛、聚乙二醇、TritonX-100等。生物制品检查---特殊杂质检查宿主细胞蛋白残留量的检查：控制异源蛋白含量以免引起机体免疫反应。生物制品检查---杂质检查外源DNA的检查：分子杂交技术生物制品检查---杂质检查外源DNA的检查：荧光染色法生物制品检查---杂质检查染料PicoGreen可与DNA双链结合形成复合物，在波长480nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测，该方法可对300pg/ml的双链DNA定量检测，其线性范围达到1.25~80ng/ml(R2>0.99)。残余抗生素的检查：氨苄西林、四环素等生物制品检查---杂质检查来源：同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体、降解产物等特点：与目标产品结构类似方法：HPLC、电泳法

产品相关杂质的检查：生物制品检查---杂质检查生物制品质量控制实例ChP人血白蛋白质量控制规程ChP乙型脑炎减毒活疫苗质量控制规程

人血白蛋白人血白蛋白由健康人血浆，经低温乙醇蛋白分离法或经批准的其他分离法分离纯化，并经60℃10小时加温灭活病毒后制成。人血白蛋白1、原料血浆2、原液（1）双缩脲法测定蛋白质含量（2）电泳法测定蛋白质纯度（3）pH值（4）残余乙醇含量人血白蛋白3、半成品检定（1）无菌检查：ChP2010附录ⅫA

（2）热原检查：家兔人血白蛋白4、成品检定（1）鉴别试验：免疫双扩散、免疫电泳（2）热稳定试验：57±0.5℃（3）化学检定：pH、蛋白质含量（4）无菌检查：ChP2010三部附录ⅫA

（5）异常毒性检查：ChP2010三部附录ⅫF

（6）热源检查：ChP2010三部附录ⅫD

乙型脑炎减毒活疫苗本品系用乙型脑炎病毒减毒株接种于原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，加入适宜稳定剂冻干制成。

乙型脑炎减毒活疫苗一、基本要求：生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求二、制造1、生产用细胞：原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞乙型脑炎减毒活疫苗2、病毒：（1）名称及来源（2）种子批的建立（3）种子批毒种的检定乙型脑炎减毒活疫苗1）鉴别试验将病毒做10倍稀释，取适宜稀释度分别与非同源性乙脑异性免疫血清和乙脑阴性血清混合，置37℃水浴90分钟，接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察5~7天判定结果。中和指数应大于1000。

乙型脑炎减毒活疫苗2）病毒滴定将毒种做10倍系列稀释，至少取3个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定。冻干种子批病毒滴度应不低于5.7lgPFU/ml；液体种子批病毒滴度应不低于7.2lgPFU/ml。乙型脑炎减毒活疫苗3）无菌检查4）支原体检查5）病毒外源因子检查

乙型脑炎减毒活疫苗6）E蛋白基因稳定性检查以E蛋白基因区核苷酸序列测定验证其遗传稳定性。编码E蛋白基因区的8个关键位点氨基酸不能发生改变。与基因库中登录号为D90195的乙型脑炎减毒株SA14-14-2株的E蛋白基因区核苷酸的同源性应不低于99.6%。

乙型脑炎减毒活疫苗7）免疫原性检查

用种子批病毒制备原疫苗，取10-3、10-4、10-5至少3个稀释度，分别免疫体重为10~12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫后14天用P3株乙脑强毒腹腔攻击，每只注射0.3ml，其病毒量应不低于500腹腔滴定的LD50。同时每只小鼠脑内接种稀释液0.03ml，接种后3天内死亡者不计，攻击后14天判定结果。ED50应不高于3.0lgPFU/ml，攻击对照组小鼠死亡率应不低于80%。

乙型脑炎减毒活疫苗8）猴体神经毒力试验用冻干主种子批进行猴体神经毒力试验，分别注射10只恒河猴的两侧丘脑各0.5ml、腰部脊髓内0.2ml。对照组用强毒SA14株稀释成102lgPFU/ml和103lgPFU/ml病毒量，以同法接种恒河猴，每个稀释度注射4只恒河猴。试验用恒河猴乙脑抗体应为阴性。

乙型脑炎减毒活疫苗对SA14-14-2减毒组的10只恒河猴观察至少21天，应无任何特异性乙脑发病症状，组织学检查仅表现为注射部位、脑和脊髓有轻微的炎症反应。而对照组SA14株在注射后8天内病毒量103lgPFU/ml组4只恒河猴应全部死亡；病毒量为102lgPFU/ml组的4只恒河猴，至少有2只死亡。组织学检查表现主要特征为神经细胞坏死，较少炎症反应。乙型脑炎减毒活疫苗9）脑内致病力试验

用种子批接种体重为12~14g小鼠，至少10只，每只脑内注射0.03ml，观察14天应存活。接种后3天内死亡者不计。3天后如有小鼠发病，应处死后取脑，测定致病力。小鼠脑内毒力应不高于3.0lgLD50/0.03ml，同时以10-1病鼠脑悬液皮下注射体重为10~12g小鼠10只，每只0.1ml，观察14天，应全部健存。

乙型脑炎减毒活疫苗10）皮下感染人脑试验用种子批毒种接种体重为10~12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应全部健存。

乙型脑炎减毒活疫苗三、检定1、单次病毒收获液检定（1）病毒滴度不少于7.01gPFU/ml

（2）无菌检查（3）支原体检查乙型脑炎减毒活疫苗2、原液检定（1）病毒滴度不少于7.01gPFU/m