植物细胞工程的理论基础

植物细胞工程的理论基础第一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日§1.细胞分化和全能性一.细胞全能性的一般概念二.细胞分化三.离体培养中细胞的脱分化、再分化第二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日一.细胞全能性的一般概念

一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。

细胞全能性的绝对性与相对性:

不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。第三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心>形成层>薄壁细胞>厚壁细胞(木质化细胞)>特化细胞(筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织>居间分生组织>侧生分生组织>薄壁组织(基本组织)>厚角组织>输导组织>厚壁组织。第五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日二.离体培养中细胞的脱分化（Dedifferentiation）

脱分化

外植体―→愈伤组织或↗体细胞胚↘完整植株

脱分化细胞↘不定器官↗

直接伸长

茎尖培养（较大时）――→完整植株

发育

幼胚培养（较大时）――→完整植株第七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。第八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。

愈伤组织的种类

1、胚性愈伤组织（Embryoneniccallus）：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。

胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。

2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。

第九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日非胚性愈伤组织胚性愈伤组织第十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日注意：

1、并不是所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。有些植物体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚。

2、多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定的差异。第十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日三.细胞分化细胞分化，是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能第十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日1．细胞分化与基因组变化

细胞分化过程中，可以观察到的最常见的变化是染色体的反复复制，而并不进行细胞分裂。核内染色体的复制过程可以区分出两种主要类型：一是核内有丝分裂，导致核内多倍体，二是大量复制染色丝，导致形成多线染色体。另一类基因组的变化是基因重排。例如，在玉米、金鱼草等植物中，转座子的移动能引起很多发育性状的改变，第十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2.细胞分化与极性建立

极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。无论是在活体还是在离体条件下，目前一般认为，极性的建立和维管成分的产生，是植物细胞分化的基本特征第十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日3.细胞分化的过程

细胞分化可分为两个阶段：1.决定：早期在动物发育研究中使用这一概念，它通常是指胚胎细胞在发育过程中发生的不可逆的特化现象。因此，决定就是细胞发育途径的确定，它是细胞分化的早期过程；2.分化细胞特征逐渐表现：在大多数情况下，细胞从决定到表现特定细胞特征通常需要经过几代细胞的传递（细胞分裂）。第十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日4.影响细胞分化的因素a.激素

生长素能促进维管组织形成细胞分裂素与木质部的发生有关第十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日激素在细胞分化中的作用，可能是通过在转录或翻译水平上的调节作用而影响相关基因的表达从而调控细胞分化。但植物中细胞种类的不同或同一种细胞不同的发育状态，均会影响该种细胞对激素的反应，即靶细胞反应差异，所以试图寻找不同激素在分化中作用的共同模式可能是很困难的。第十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日b、蔗糖浓度第十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日C、光照与温度

光照对于维管组织的分化具有促进作用，适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。第十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日§2.器官发生一．离体培养中器官发生的方式二.器官分化的过程三.影响器官分化的因素第二十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日植物的离体器官的发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的过程。

不定根：从茎、叶上生出的根叫做不定根

不定芽：不是从叶腋或枝顶发出，而是从叶子、根上或从树干上发出的芽

第二十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第二十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日一.离体培养中器官发生的方式通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：第一种方式是先芽后根；如小麦，芦荟、苹果第二种方式为先根后芽；如枸杞、苜蓿等第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石刁柏第二十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日二.器官分化的过程离体条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段

1.外植体经过诱导形成愈伤组织。

2.生长中心的形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟分生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。

3.器官原基及器官形成。生长中心形成后，按照其已确立的极性，某些细胞开始分化形成管状细胞，进而形成微管组织，开始形成不同的器官原基，进而分化出相应的组织和器官。第二十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日生长中心（拟分生组织）器官原基芽形成第二十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基，有两种情况，一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，另一种情况是外植体形成分生细胞团后在分生细胞团上直接形成器官原基。第二十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日一般认为，芽和茎原基通常起源于培养组织中比较表层的细胞，即外起源，而根原基则发生在组织较深处，是内起源。第二十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日三.影响器官分化的因素1.外植体-位置、状态及组织类型（芦荟、小麦）外植体的状态和组织类型影响诱导和分化的难易；外植体的部位直接影响器官分化的类型。例如：芦荟第二十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第二十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第三十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日有变态器官（如鳞茎、球茎、块茎等）的植物，在培养中往往也容易形成相应的变态器官，如百合、水仙等鳞茎类植物培养中往往易形成小鳞茎；马铃薯等块茎植物培养中则可观察到块茎的形成。这一特性也使以变态器官为繁殖体的植物实现实验室工厂化生产种子提供了可能。第三十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2.生长调节剂

生长调节剂在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物生长调节剂来实现的。种类、浓度和不同类型生长调节剂的比例是影响根芽等分化的关键。第三十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日3.光照光照有利于维管组织和叶绿体形成进而分化芽

愈伤组织的诱导培养一般是在黑暗或弱光照条件下进行的，细胞中完全没有维管成分，当转入强光照条件下以后，才能逐渐变绿并形成维管组织。分化培养的初期连续光照能促进愈伤组织变绿，随后的昼夜交替则有利于细胞极性的建立，从而促进器官分化。有些植物，只有在一定的光周期条件下才能分化芽，如天竺葵的愈伤组织进入器官分化培养，一般要在16h/d光照和8h/d黑暗条件下才能分化芽。第三十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日4.温度

愈伤组织诱导培养时，温度可以适当提高，而分化温度比诱导温度要低。如烟草，愈伤组织生长时33℃仍可良好生长，而分化则必需在18℃条件下才适宜。与光周期相似，某些需要通过低温春化的植物，在离体培养中器官形成有时也需要低温处理，特别时对于某些特殊目的的培养，需要考虑这一因素，如菊苣根培养产生的愈伤组织，诱导分化时经低温处理可形成花芽，而在25℃下培养只能形成营养芽。第三十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日§3.离体培养下的遗传与变异一、培养细胞变异的类型二、变异原因三、影响离体培养细胞遗传变异的因子四、体细胞无性系变异的诱导五、优良变异的筛选方法六、体细胞无性系变异的利用七、变异的抑制第三十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日一、培养细胞变异的类型

离体培养中，组织、细胞、原生质体培养再生植株中，会有各种各样的变异。例如，叶色、花色的变异，株高、果实大小的变异，染色体结构和数目的变异，由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的重组和交换。由于它们没有发生有性过程，因此，我们把在组织培养条件下所表现的遗传与变异特征称之为体细胞遗传与变异，由此发展起来的遗传学分枝称为体细胞遗传学。第三十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日培养细胞变异的类型

1、自发产生的变异，即培养物在未加诱变因素的情况下产生变异。

2、诱发产生的变异，即培养物在诱变因素作用下产生变异。

前者变异率一般在10-7~10-6之间，后者一般在10-5~10-4。

第三十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日1、自发产生的变异A.染色体多倍性和非整倍性第三十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日B.畸形变异

最常见的变异是白化苗突变，其次是产生丛生芽、肉质茎芽等。第三十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第四十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日

安祖花第四十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日C.非遗传变异a、外遗传变异（epigeneticvariation)在植物愈伤组织培养过程中，常常出现一种不涉及基因结构的变化，而只是在基因表达水平上的变异，如最常见的生长素自养型变异。这种变异不能通过有性世代传递给后代植株，但在离体条件下却可以经过培养继代，长期保存。（马铃薯）第四十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日b、生理适应（physiologicadaptation）变异

通常是在某种外界条件存在时才表现出变异，外界条件不存在时，变异也随之消失第四十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2、诱发产生的变异（抗镰刀菌毒素细胞变异系的分离）

将诱导产生的愈伤组织接种在含不同浓度梯度毒素的培养基上

筛选得到半致死剂量浓度、100%生长抑制生长浓度、致死计量浓度

以半致死剂量为最低浓度，逐代增加毒素浓度至致死剂量浓度

转移至无毒素培养基继代培养两代

转移到致死剂量和高于致死剂量的培养基培养，统计存活率第四十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日二、变异原因：

1、

植物本身的异质性（嵌合性）（不是真正意义上的突变）

无性繁殖植物的体细胞中，存在广泛的异质性（如体细胞突变等原因造成），在整体中被掩盖，无法表现出来。在离体培养中，原来具有不同类型的细胞被诱导分裂，由这些变异的细胞再生的植株为变异植株，经过一定的选择，选育新品种。

第四十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2、培养条件引起的变异

变异原因可能与如下因素有关：

1）

培养基中添加的激素

2）

形成愈伤组织过程中，细胞分裂异常

3）环境条件的改变（温度、光照时间及强度与原来生长环境不同）第四十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日三.影响离体培养细胞遗传变异的因子1、供体植株

倍性水平、基因型、外植体细胞的分化程度

2、培养基及培养方式

培养基的成分、物理状态及培养类型

原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异

3、继代培养的次数

一般来讲，继代时间越长、继代次数越多，细胞变异的几率越大。第四十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日四.体细胞无性系变异的诱导

自发变异往往频率较低，为了增加变异频率，在培养基中添加化学诱变剂或使用物理方法处理，这样，细胞群体中就会产生各种各样的变异第四十八页，共六十二页，编辑于2023年，星期日诱变剂类型：

诱变剂包括物理的和化学的两大类。

物理诱变剂：X射线、γ射线、中子、β粒子、α粒子和紫外线等。

化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂和某些抗生素类等。

作用机理各不相同。第四十九页，共六十二页，编辑于2023年，星期日五、优良变异的筛选方法

1、离体条件下体细胞无性系变异的筛选的优点：

（1）可以在小空间内对大量个体进行选择

（2）不受季节限制，筛选效率高

（3）诱变和筛选条件可以根据需要进行调节和控制，提高了试验的重复性。

（4）理化诱变剂可较均匀接触细胞，因此可以引起培养细胞较高频率发生突变，增加了选择机会

（5）变异是在单细胞水平上进行的，避免了整株水平上常呈现出的嵌合体，可以省去变异分离的麻烦。第五十页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2、体细胞变异材料的选择

选择起始材料需根据试验目标确定，一般应考虑（1）目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。

（2）必须充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生植株，则不能进行后继的各项操作。

第五十一页，共六十二页，编辑于2023年，星期日（3）适当的细胞类型也是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。

虽然各种状态下的培养细胞均可以作为分离突变细胞的来源，但实践中原生质体和悬浮细胞系被优先考虑第五十二页，共六十二页，编辑于2023年，星期日3、筛选方法

（1）直接筛选法

在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体，如抗除草剂、抗盐突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质

。

另外也可以在再生植株水平上进行筛选。第五十三页，共六十二页，编辑于2023年，星期日A培养及筛选过程（在细胞水平上）：

组织、器官、愈伤组织、原生质体等

↓诱发变异处理、筛选压

耐性愈伤组织

↓

再生植株

↓鉴定

耐性植株

第五十四页，共六十二页，编辑于2023年，星期日B培养及筛选过程（在再生植株水平上）：

组织、器官、愈伤组织、原生质体等

↓诱发变异处理

愈伤组织

↓

再生植株

↓筛选压

耐性植株

第五十五页，共六十二页，编辑于2023年，星期日第五十六页，共六十二页，编辑于2023年，星期日2、间接筛选法

间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。

抗病突变体的筛选也常常用间接筛选的策略。由于在离体培养中直接接种病原物会严重阻碍细胞生长，因此可以在培养基中加入一定剂量的病原物类毒素来增加选择压力。第五十七页，共六十二页，编辑于2023年，星期日体细胞无性系变异的表示方法：

（1）Chaleff提出的以R0、R1、R2、….分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代

（2）Larkin和Scowcroft提出的SC1、RC2、RC3…..分别代表当代和自交以后的世代第五十八页，共六十二页，编辑