植物细胞工程制药

植物细胞工程制药第一页，共五十六页，编辑于2023年，星期六植物细胞工程的主要研究内容：植物细胞全能型的本质、细胞分化机制、代谢途径的调控、培养细胞中的生理和遗传的变异、体细胞杂交和有性杂交的比较、不亲和的机制、细胞大规模培养的动力学参数的建立等、细胞和组织培养方法的改进、细胞器的分离和引入、原生质体诱导融合和杂种的培养筛选和鉴定、花粉和花药培养、培养细胞中有用成分的鉴别及分离方法的建立、试管苗的大规模繁殖和生产等。第二页，共五十六页，编辑于2023年，星期六第一节概述1.植物细胞的全能性：植物体中的任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。1953年，单个胡萝卜细胞培养成整株植株。基本概念2.植物组织和器官培养：是指在无菌和人工控制条件下（培养基、光照、温度等），研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。第三页，共五十六页，编辑于2023年，星期六3植物的分化：指在个体发育中，相同细胞后代在形态、结构、生理功能上产生稳定性差异的过程。（细胞分裂是细胞分化的基础，生物体的生长发育是细胞分裂和细胞分化共同作用的结果。）植物分化可分为胚胎发生和器官发生两个阶段，胚胎阶段是指从精子与卵细胞结合开始分化为幼胚，进而发育为成熟胚和种子，器官发生阶段指种子在适宜条件下萌发后，分化形成根、茎、叶和果实。4脱分化：已经分化的植物器官、组织或细胞，当受到创伤或进行离体（也受到创伤）培养时，已停止分裂的细胞，又重新恢复分裂，细胞改变原有的分化状态，失去原有结构和功能，成为具有未分化特性的细胞，又叫做去分化。第四页，共五十六页，编辑于2023年，星期六5.再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。愈伤组织形成胚状体的途径：①由体细胞或性细胞，通过脱分化形成胚状体；②通过愈伤组织直接形成胚状体。6.愈伤组织：在植物伤口或在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。第五页，共五十六页，编辑于2023年，星期六7.植物无菌培养：指在无菌或人工控制条件下（培养基、光照、温度），研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。主要技术有：（1）幼苗及较大植株的培养；（2）从植物体的各种组织、器官等外植体，经脱分化而形成的细胞聚集体的培养；（3）保持良好分散性的单细胞和较小细胞团的液体培养；（4）植物离体器官的培养；（5）未成熟或成熟的胚胎的离体培养。第六页，共五十六页，编辑于2023年，星期六8.细胞培养：利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化的培养试验，目的是获得单细胞无性繁殖系。9.分生组织培养：即生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。（分生组织是在植物体的一定部位，具有持续或周期性分裂能力的细胞群。）10.外植体：用于植物组织（细胞）培养的器官或组织，即从活体植物上切下来用于培养的组织或器官。植物根、茎、叶、花、果、胚珠、胚乳、花药、花粉等都可以作为外植体。第七页，共五十六页，编辑于2023年，星期六11.无性繁殖系：即克隆，又叫无性系。从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代,是具有相同遗传性状的群体。在植物细胞工程中即指通过同一个外植体获得越来越多的无性繁殖后代。12.突变体：经过证实已发生遗传变异或新的培养物至少是通过一种诱变处理而发生变异所得的新细胞。13.继代培养：在最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称之为第一代培养，连续多代培养即为继代培养，有时也称连续培养。第八页，共五十六页，编辑于2023年，星期六14.次级代谢产物：指生物体生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物体无明显生理功能，或并非是生物体生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。次级代谢产物特征：（1）有明显的分类学区域界限；（2）其生物合成需在一定的条件下才能发生；（3）缺乏明确的生理功能；（4）是生命活动的多余成分。第九页，共五十六页，编辑于2023年，星期六第二节植物细胞工程发展简史略第三节植物细胞的形态及生理特性一、植物细胞的形态植物细胞是构成植物体的基本单位。植物细胞的形状多种多样，根据植物种类、存在部位和功能而有所不同。第十页，共五十六页，编辑于2023年，星期六第十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期六二、植物细胞的结构特征高等植物细胞都是真核细胞，具有典型的，被双层膜包被的细胞核。植物细胞由细胞壁和原生质体两大部分组成。植物细胞的基本特征是含有刚性的细胞壁和大的液泡。细胞壁分为初生细胞壁和次生细胞壁，二者的主要成分都是纤维素。原生质细胞质细胞核液泡生命活性物质无生命物质（后含物）第十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期六第十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期六第十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期六三、植物细胞的主要生理活性物质及其它化学组分生命物质和后含物都是细胞代谢过程的产物。生命物质（酶、维生素、激素和抗生素等）含量少，对细胞内生化代谢和生理活动起重要的调节作用；后含物（生物碱、苷类、有机酸、挥发油、糖类、盐类等）多为贮藏物质和废弃物质，多存在于液泡内。第十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期六1.生理活性物质生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。（1）酶有机催化剂，生物体内所有的反应都是在酶的催化作用下进行的。第十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期六酶的特性：

①酶具有高效率的催化能力，其效率是一般无机催化剂的107~1013倍。②酶具有专一性，每一种酶只能催化一种或一类化学反应。③酶在生物体内参与每一次反应后，它本身的性质和数量都不会发生改变。④酶的作用条件较温和，酶所催化的化学反应一般是在比较温和的条件下进行的。最适温度、最适pH。第十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期六（2）维生素

维生素是生物的生长和代谢所必需的微量有机物。维生素脂溶性维生素水溶性维生素维生素A维生素D维生素E维生素K维生素B族维生素C维生素作用：

生命体内主要作为酶的辅酶或辅基，也做为合成其他物质的原料。第十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期六（3）植物激素植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的几类微量有机化合物。

已知有七类：脱落酸、植物生长素、细胞分裂素、乙烯、赤霉素、寡糖素和油菜固醇内酯（油菜素甾醇）。（4）抗生素和植物杀菌素抗生素是由微生物产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质（青霉素、链霉素等）。

高等植物如葱、姜、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌物质，称为植物杀菌素。第十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期六2.后含物（1）生物碱

生物碱是一类含氮的有机化合物，常用于药物中，如麻黄碱、咖啡因、阿托品、奎宁等。（2）糖苷类某些化合物和糖经糖苷键结合而成的化合物。第二十页，共五十六页，编辑于2023年，星期六（3）挥发油是一类常温下具有芳香气味并易于挥发的油类，很多可作药用（薄荷油、丁香油、桉油等）。（4）有机酸有机酸是糖类代谢的中间产物，是植物果实及细胞液中酸味产生的主要原因。第二十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期六四、植物培养细胞的生理特性主要特征：1.细胞个体大（较微生物细胞大得多）抗剪切力差；2.生长速度慢易被微生物污染，培养时需添加抗生素；3.细胞易聚集成团，难进行悬浮培养；4.培养时需供氧，但培养液黏度大，不受强力通风搅拌；5.具有群体效应及接触抑制性；6.细胞培养物滞留于细胞内，产量低；7.细胞具有结构和功能全能性，即细胞可以分化为完整的植株。第二十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期六五、植物细胞不同生长阶段的特征1.延迟期：细胞分裂的初始期和最大生长期之间。2.加速期：细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳DNA和蛋白质积累率。3.对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。4.稳定期：细胞数稳定。第二十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期六第四节植物细胞培养的基本技术a.从普通的生长环境中分离植物组织b.利用无菌技术对所需的植物材料进行无菌处理（以获得清洁的材料）c.在严格控制的物理和化学环境中对植物材料进行培养和维持d.将植物组织还原成可以种植的植株。植物细胞培养的基本技术：a.植物材料的准备b.培养基的制备c.培养方法的选择培养过程：第二十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期六一、植物材料的准备植物组织的选择取决于工作目标，植物的任何部分几乎都能诱导而产生愈伤组织。

从年轻的植株上取得外植体，避免患病或太老的组织。种子也是比较合适的材料之一（种子比柔嫩的植物组织更易于灭菌）。外植体必须是无菌材料。用于植物组织培养的表面灭菌剂应选择那些灭菌后容易除去或者容易分解的试剂。常用的灭菌剂有：次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞。第二十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期六灭菌步骤：①植物材料清洗干净②70%酒精浸泡30-60min后取出③浸入灭菌剂溶液中，15min取出④无菌水清洗3遍（除去消毒剂）。整个过程在无菌室或是超净台上进行，以保证在消毒灭菌后不再被污染。灭菌时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性，敏感的外植体灭菌时间不宜过长，而不敏感的则可以适当延长灭菌时间，以达到更好的效果。第二十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期六不同植物组织、器官的灭菌时间和过程第二十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期六二、培养基及其组成培养基：是植物离体器官、组织或细胞等的“无菌土壤”，其特点是营养成分的可调控性。培养基的种类很多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长素、维生素等化学成分。应用最广泛的是MS培养基。1.无机盐大量元素（N、P、K、Ca、Mg、S、Cl、Na）和微量元素（Fe、Mn、Zn、Cu、Mo、B）。第二十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期六2.碳源植物细胞培养物多为异养细胞，经常使用糖类、肌醇作为碳源，有时也用甘油代替。3.植物生长调节剂生长调节剂是指植物代谢过程中自身形成的植物生长调节因子，在极低浓度时即可调节植物的生长和发育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用，如植物生长素、细胞激动素（分裂素）、赤霉素脱落酸和乙烯。第二十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期六4.有机氮源植物组织和细胞培养试验中有机氮源多为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸，该类物质的添加对细胞的早期生长有利。5.维生素植物组织和细胞通常能合成一定的维生素，但一般自身的合成量不能满足植物细胞的需要，必须加入B族维生素和一定量的生物素和肌醇。第三十页，共五十六页，编辑于2023年，星期六三、培养方法植物细胞的主要培养方法按培养对象分可分为：原生质体培养和单细胞培养；按培养基类型可分为：固体培养和液体培养；按培养方式可分为：悬浮培养和固定化细胞培养。第三十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期六固体培养：在培养基中加入一定量的凝固剂（如琼脂），经加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基，在该培养基上进行植物组织培养的方法称为固体培养。固体培养最常用的固化剂是琼脂，最适浓度为0.6%-1.0%，一般培养温度为（25±1）℃，需光照，以每天16h为宜。细胞培养的常规操作是固体培养和液体培养相互配合使用。第三十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期六实际生产中，要实现大规模的培养，主要采用成批培养、半连续培养和连续培养。1.成批培养法成批培养：将培养基一次性加入反应器中，接种，培养一定时间后收获细胞的操作方式。最适于植物细胞培养的生物反应器是气升式反应器。第三十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期六在植物培养过程中，次级代谢产物的大量积累一般发生在细胞生长的稳定期，为避免次级代谢产物的大量积累，常采用两步培养法。

使用两个生物反应器。第一个用于细胞生物量的积累，第二个用于次级代谢产物的生产。

紫草宁第三十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期六2.半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。每隔一天或两天收获一部分培养物（最多可达50%），然后补充等量新鲜培养基。第三十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期六3.连续培养连续培养是在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。连续培养法要维持系统的无菌状态，技术条件比较苛刻。第三十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期六4.固定化培养法采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中孔纤维膜等多种类型。优点：（1）细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体；（2）易于维持细胞间物理化学梯度；（3）有利于细胞组织化；（4）易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。第三十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期六固定化培养常采用固体培养，优点是操作简便易行、培养所占空间小。

缺点是：

（1）培养基中营养物质的浓度差导致愈伤组织生长不平衡；（2）气体交换不畅，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，堆积有害物质；（3）静止状态下，由于重力作用和向光性导致细胞群体不均匀；（4）培养时需测定一些生理生化指标，此时需转入液体中，会改变组织的形态和生理状态。第三十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期六第五节影响植物次级代谢产物积累的因素在植物组织培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和累计的因素有：（1）生物条件：如外植体、季节、休眠等（2）物理条件：如温度、光、通气等（3）化学条件：如无机盐、碳源、维生素等（4）工业培养条件：如培养罐类型、通气等第三十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期六一、外植体选择不同外植体的悬浮细胞培养物，它们的最大次级代谢产物的积累时间各异，同一化合物可以在不同的外植体的不同生长阶段中积累，无论是延迟期、加速期、对数期还是稳定期都能够大量积累次级代谢产物。第四十页，共五十六页，编辑于2023年，星期六二、培养条件的影响培养条件的影响可分为培养环境的内在因素（营养、元素、pH、通气、混合程度、接种等）和培养环境的外部因素（剪切力、搅拌频率、温度、光等）的影响。1.培养环境的内在因素（1）接种和诱导:次级代谢产物的产率与外植体大小、细胞密度及营养成分密切相关。大小适中；细胞生长率增加，次级代谢产物产量降低；营养充足，次级代谢产物产量高。第四十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期六（2）基本培养基的组成基本培养基是植物组织和细胞生长的物质基础。①磷，低于基本培养基的含磷量容易导致次级代谢产物的积累，但磷缺乏又会导致组织或细胞生长的大幅度降低，使得细胞的生物量大幅度减少，这就导致高次级代谢产物产出的细胞株比低产出细胞株的经济效益差，因为低产出细胞株可以通过增加生物量的方式补偿。

②氮，植物组培常用氮源为NO3-和NH4+，不同的植株种类和细胞系，对两种氮源的需求不同，有的植株只能利用其中某一种作为单一氮源，有些需要两种氮源，还有些细胞需要一些特殊氮源：天冬氨酸、尿素、蛋白胨等。

细胞生产能力通常取决于NO3-和NH4+之比，高于或者低于最佳比例都会对细胞生长和次级代谢产物的积累产生不利影响。③Cu，是次级代谢产物积累的必要元素，相对较高而无毒条件下，Cu还可以作为诱导剂使用。第四十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期六（3）碳源使用最多的碳源是糖类，其影响主要取决于使用的糖类的种类和浓度及其次级代谢产物的生物合成过程。常用于植物培养的糖有蔗糖、葡萄糖和甘露糖。糖的作用：①延长稳定期；②通过葡萄糖对内源性生长素合成的抑制；③增强戊糖磷酸化途径有关酶的活性。第四十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期六（4）植物生长调节剂植物生长调节剂在植物细胞培养中起关键性作用，但无规律可循，必须通过反复实验才能确定合适的数量和种类。（5）O2和pH①O2，维持细胞正常的呼吸作用，通常采用搅拌和通气的方式提供。②pH，植物细胞生长最适pH为5—6之间。常用培养基一般都有缓冲作用，培养过程中培养液的pH变化较小。第四十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期六（6）渗出物植物培养过程中，从细胞中分泌到培养液中的一些代谢产物，这些渗出物取决于培养的营养条件和细胞培养的发育阶段。第四十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期六2.两步培养法在植物细胞培养过程中，选择合适的培养基对于次级代谢产物的的生产非常成功，但是想同时获得最佳生长和最佳次级代谢产物的的产量是很困难的，科学家通过两步培养法解决了此矛盾。 第一步利用适宜细胞生长的培养基——生长培养基，第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基——生产培养基。前者是为了实现细胞高产的目的，后者含有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分和碳源。第四十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期六3.培养环境的外部因素（1）温度：最佳温度为20—28℃。（2）搅拌频率：产率与发酵罐的搅拌速度有关。（3）培养容器的影响：次级代谢产物的产生与所用培养容器的大小和搅拌装置的不同而不同。（4）光的影响：一个重要因素，有关因素：光照时间的长短、光质、光的强度。第四十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期六第六节植物细胞培养的生物反应器工业上用于植物细胞培养的生物反应器主要主要有五种类型。1.机械搅拌式生物反应器对搅拌器加以改进。优点：反应器内的温度、pH、溶氧及营养物质浓度较其他反应器更易控制。第四十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期六2.鼓泡塔式生物反应器通过位于底部的喷嘴及多孔板而实现气体分散。优点：没有运动部件，操作不易染菌，在无机械输入情况下，提供较高的热量和质量传递，适于对剪切力敏感的细胞的培养，放大相对容易.缺点：流体流动形式难以确定，混合不匀，缺乏相关数据。第四十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期六3.气升式生物反应器优点：结构简单，没有泄露点和死角，可以在低剪切力下达到较好的混合和较高的氧传递效果，不易污染，操作费用很低。缺点：高密度培养时混合不够均匀。第五十页，共