大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化优质资料

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8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化优质资料(可以直接使用，可编辑优质资料，欢迎下载）大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lacoperator，T5/lacoperator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His,Strep-TagⅡ，S-tag，MBP等。其中His-Tag和GST-Tag是目前使用最多的。HisTag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GEHealthcare（原Amersham）提供。宿主菌的选择重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliDH10B，E.coliNovaBlμe等recA–和endA–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主：BL2：lon和ompT蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。BL21（DE3）：DE3噬菌体溶源于BL21形成的带有染色体T7RNA聚合酶基因大肠杆菌。IPTG诱导的lacΜV5启动子控制T7RNA聚合酶基因表达T7RNA聚合酶，进而控制T7表达系统表达目的蛋白。BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami（DE3），OrigamiB（DE3）和Rosetta-gami（DE3）菌株带有trxB和gor双突变。拥有trxB和gor突变的菌株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。Rosetta™系列：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。BL21-CodonPlus系列：包括BL21-CodonPlus®（DE3）-RIPL，BL21-CodonPlμs®-RIL，BL21-CodonPlμs®（DE3）-RIL,BL21-CodonPlμs®-RP，BL21-CodonPlus®（DE3）-RP等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（L），异亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA基因，更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene公司资料）。M15/SG13009：自身表达T5RNApolymerase，主要用于pQE系列载体的表达。另一个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。表1大肠杆菌密码子使用频率统计TAAFRQCAAFRQAAAFRQGAAFRQTTTTF19.7TCTS5.7TATY16.8TGTC5.9TTCF15TCCS5.5TACY14.6TGCC8TTAL15.2TCAS7.8TAAstop1.8TGAstop1TTGL11.9TCGS8TAGstop0TGGW10.7CCTTL12CCTP8.4CATH15.8CGTR21.1CTCL11CCCP6.4CACH13.1CGCR26CTAL5.3CCAP6.6CAAQ12.1CGAR4.3CTGL46.9CCGP26.7CAGQ27.7CGGR4.1AATTI30.5ACTT8AATN21.9AGTS7.2ATCI30.6ACCT22.8AACN24.4AGCS16.6ATAI30.7ACAT6.4AAAK33.2AGAR1.4ATGM30.8ACGT11.5AAGK12.1AGGR1.6GGTTV16.8GCTA10.7GATD37.9GGTG21.3GTCV16.9GCCA31.6GACD20.5GGCG33.4GTAV16.1GCAA21.1GAAE43.7GGAG9.2GTGV16.11GCGA38.5GAGE18.4GGGG8.68.2表达条件的建立为了方便后续的纯化操作,保持目标蛋白的活性,提高蛋白的得率，我们在进行蛋白的大量制备之前应该首先确定目标蛋白的最佳表达条件。首先，保证表达蛋白稳定，尽量避免蛋白酶的降解，我们可以通过使用一些蛋白酶缺陷性的表达宿主，其次在表达的过程中可以在培养体系中添加一些蛋白酶抑制剂等来解决。与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时候保证目标蛋白的可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。很多外源基因在大肠杆菌表达时很容易形成不可容的包涵体，其原因可能有：表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体；蛋白合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。目前对包涵体的形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚,但已经报道了很多用于优化表达以增加目标蛋白可溶性的方法。确定表达状况转化构建好的质粒至表达宿主感受细胞，挑取单克隆子至5ml含有相应抗性的LB培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600=0.5左右，加入IPTG至终浓度0.2mM，转移至28℃，200rpm继续诱导培养，可以在2h，4h，将取出的1ml菌液12000rpm离心1min，收集菌体，加入1mlPBS缓冲液重悬沉淀，同样离心1min。再加入300～500mlPBS重悬细胞。超声破碎细胞（具体见操作细胞破碎）将破碎液体4℃，12000rpm离心10minSDS分析上清和沉淀的蛋白分布（具体操作参考SDS）。若在上清中有明显的目的蛋白的条带，即可以放大培养进而纯化目标蛋白。若目标蛋白的表达主要分布于沉淀，则可以尝试一下几种方法来改善表达。改变表达载体下手，像GST，NΜS，MBP,TrxA等融合标签能够提高很多蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性，此外一些分泌标签如ompA,Pet-22b上的pelB也能够将目标蛋白运输至细胞的周质空间，从而提高目标蛋白的可溶性。降低表达速度，可采取低温诱导，如15℃尝试一些特殊设计的表达宿主Origami：thioredoxinredμctase/glμtathioneredμctase双突变适合带thioredoxinredμctase的融合表达载体，帮助形成更多的二硫键。对于一些蛋白可能无法实现可溶性表达，这时候溶解包涵体后再纯化是唯一的解决办法。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）大肠杆菌表达纯化外源蛋白，SDS是必不可少的操作。可以用来检测蛋白的表达情况(表达量，表达分布等)，用来分析纯化的目的蛋白的纯度。本小节列出SDS操作中一些试剂的配置及其基本的操作过程。.1主要试剂的配置（1）30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4℃丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。建议实验室划出专门的台面，设置单独的配置器皿进行SDS的相关实验。（2）1.5mol/LTris（pH8.8）溶液。（3）10%SDS溶液：SDS10.0g加入ddH2OToTo100。（4）10%过硫酸铵：新鲜配制。（5）TEMED溶液：4℃（6）1.0mol/LTris（pH6.8）溶液。（7）2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液。（8）5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：15.1gTris，94g甘氨酸和5gSDS定容到1000ml（建议每次电泳用新稀释的缓冲液）。（9）考马斯亮蓝R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，搅拌溶解。（10）脱色液：10%冰醋酸（可加如乙醇，建议不要使用甲醇）。.2主要操作步骤1、凝胶制备（1）安装洗涤干净的玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中。（2）配制10%的分离胶（具体参考表2）：迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层异丙醇或水。（3）在分离胶聚合的过程（可置于37℃，约10min）中，配制5%的积层胶（参考表格3（4）分离胶聚合完全后，倒去异丙醇或水，用滤纸吸干胶面上的残余。（5）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。（6）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，拨去封胶用的塑料条，固定于电泳槽。（7）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。2、样品的制备在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液，混合液在沸水浴中加热5min，冷却后即可上样。3、上样用微量移液器上样，每加入一种样品，上样量根据根据具体的样品浓度确定，未知浓度一般用10微升。4、电泳对于一块胶，在浓缩胶中电流设置在15～20mA,

当染料进入分离胶后可设置电压至电流约为25～30mA，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。5、后处理（1）染色：加入染色液（用量同上），室温染色30min～1h。Tip：染色前可将染色液在微波炉里加热至沸，然后摇床震荡染色约10min即可。（2）脱色：将染色后的胶块用水洗涤三次去除表面染料，然后加入脱色液脱色，其间更换脱色液3～4次至条带清晰。Tip：10min快速脱色:将脱色液置于微波炉煮沸，更换三次脱色液。表2.配制SDS不同浓度分离胶的配置不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）Gel%组成所需要各成份体积（ml）510152025306%水2.65.37.910.613.215.930%丙烯酰胺溶液1234561.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0248%水2.34.66.99.311.513.930%丙烯酰胺溶液1.32.745.36.781.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.01810%水1.945.97.99.911.930%丙烯酰胺溶液1.73.356.78.3101.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.01212%水1.63.34.96.68.29.930%丙烯酰胺溶液246810121.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.01215%水1.12.33.44.65.76.930%丙烯酰胺溶液2.557.51012.5151.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.3TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.012

表3.SDS%浓缩胶的配置Gel%组成所需要各成份体积（ml）1234565%水0.681.42.12.73.44.130%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.0mol/LTris(pH6.8)0.130.250.380.50.630.7510%SDS0.010.020.030.040.050.0610%过硫酸氨0.010.020.030.040.050.06TEMED0.010.020.030.040.050.06

8.3细胞破碎获取蛋白质大肠杆菌细胞破碎有很多方法，譬如反复冻融法，渗透冲击，超声破碎，压力破碎等。其中超声破碎和压力破碎破碎是我室常用方法。超声破碎在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。离心1.0～1.5ml诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入300～500μl的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎。因很多实验室有自己的小型超声粉碎器,各个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。常规操作步骤如下（以100ml培养液为例）：（1）100ml诱导后的菌液（OD600=1.2左右），12000rpm，4℃离心2min（2）加入预冷的缓冲液50ml，重悬细胞洗涤菌体一次，12000rpm，4℃离心2min，收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为PBS或者Tris-NaCl（3）向沉淀中加入15ml的缓冲液同上（若菌体太浓，可加倍），充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。（4）破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％。（5）分离上清和沉淀：12000rpm，4℃离心20min（6）SDS分析蛋白表达情况。（7）准备纯化蛋白。超声破碎注意事项与一些小的改进：（1）破碎完全的判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。（2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。（3）超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。（4）尽量防止泡沫的产生。（5）大量破碎时将菌液置于一玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热，减小对蛋白的破坏作用。（6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）处理破环细胞壁（10min，30℃压力破碎高压破碎是大量的破碎提取细胞内成份的首先方法，相对于超声破碎，它具有过程温和，操作迅速等优点，具体使用需要根据具体的仪器使用说明。FRENCH®PRESS细胞破碎仪标准操作规程（1）使用前将高压腔、底座、活塞杆在4℃冰箱中预冷30min（2）将三脚固定器置于水平桌面上，将高压腔正放在固定器器上；在活塞杆的O型环、底座的O型环和针形阀的O型环上均匀涂上少量凡士林。（3）

把活塞杆正向插入高压腔至最大加样线，将整个腔体连同活塞杆一起倒转固定在固定器上。（4）

将菌液倒入腔体，最大处理量为35ml，最小为5ml。视样品体积，大致估计并调整活塞杆的位置。（5）将针形阀和样品喷射管装配于底座上，针形阀拧到轻轻不能拧动为止，并向反方向稍微松动，保证阀门处于开启状态（注意：务必不能用力拧紧，否则会降低其密封性）。把底座倒扣于腔体上，向上调整活塞杆的位置，直至腔内空气完全排出，流出一滴样品为止，轻轻旋紧针形阀。（6）双手托起整个高压腔组件，翻转至正向位置，将其置于升降台上（事先要确保操作台足够的低，以容的下整个组件），向后推动底座，使底座固定于三个位置校准针之间，并调整腔体使针形阀朝向正面。将固定夹固定于支持杆上，拧紧固定夹上的两个螺丝以固定腔体。将活塞杆上的手柄转至与固定夹垂直的方向。（7）

打开电源，将档位手柄转至HIGH档，顺时针旋转压力控制阀至50psi，升降台开始上升，当活塞杆接触上顶台后，继续顺时针旋转压力控制阀，直至压力达到需要的压力（大肠杆菌的破碎压力一半设定为12000psi，芽孢杆菌设定为2000psi）。（7）取一冰预冷的离心管（或者将离心管至于冰中）置于样品喷射管出口处，轻轻逆时针转动针形阀，小心控制样品的流出速度，根据破碎程度决定流速（建议在喷射管出口处接一个1cm长的透明的塑料管如输液管，通过观察塑料管流出样品的透明度来判断破碎是否完全）。当活塞杆上的安全指示线（StopLine）降至腔体上表面时，迅速关紧针形阀（不要过紧），旋转档位手柄至DOWN位置。待升降台完全下降后，继续降低压力至零，关闭电源。（8）松开固定夹，取出高压腔，重新倒置于三脚固定器上，取出底座。将各部分拆开，彻底清洗。底座及喷射管的内壁要重点冲洗，涂有凡士林处要用洗洁精彻底洗净。【注意事项】（1）仪器最大承受压力为4000psi（指示针2500）。（2）各O形环处（包括样高压腔，底座，活塞杆和针形阀）一定要涂凡士林润滑，以降低磨损，防止损伤。（3）压力的升高或降低速度要控制在一定范围内。升高压力前务必保证整个组件固定于升降台上,任何的松动可能导致事故。（4）活塞杆的手柄要与固定夹垂直，否则会发生危险。（5）严禁将出样阀过分拧紧，否则会损坏内部撞针，以不流出液体为准。（6）严禁使活塞杆下至安全线以下，否则会导致活塞杆与底座损坏。（7）使用完毕要将压力控制阀转至压力为零。（8）各部件清洗要彻底，否则底座小孔容易堵死，活塞杆上残留的菌体会在未洗净的凡士林上滋生。（9）长期不用应保存在干燥的环境中，必要时可涂凡士林防止生锈。（10）压力腔的空气一定要完全排出，否则当样品完全排出时，造成活塞与压力池底座直接接触，造成损伤，由于压力非常大，有可能导致活塞或压力池底座变形，造成永久性损伤！（11）在搬动装好的样品池时，一定要双手，一手扶住住高压腔，一手托住底座，防止底座脱落而造成事故。（12）O型环若老化则及时更换。（13）操作过程中禁止将液体溅入机箱内部。（14）仪器使用过程中出现故障应及时与负责人联系。8.4目的蛋白的纯化HisTag纯化操作实例本实验室中所用的表达载体pET28a（+）中含有一个编码多聚组氨酸的序列，即His-Tag，因此会获得带有His-Tag的重组目标蛋白。His-Tag可与金属Ni2+离子结合，从而有利于目标蛋白的纯化。加上了His-Tag的蛋白在非变性的条件下可用Ni2+亲和层析柱纯化。纯化蛋白的原理是：当亲和层析柱负载了Ni2+后，可以选择性吸附暴露在蛋白表面具有复杂结构的氨基酸残基（特别是组氨酸残基）。蛋白质中含有的组氨酸越多，与Ni2+结合的特异性就越高，则将其洗脱下来会需要更高的咪唑浓度。含有组氨酸标签的目标蛋白与细胞中的总蛋白相比，具有更高的Ni2+结合特异性。为了得到具有较高纯度的目标蛋白，必须找到一个合适咪唑浓度的洗脱液（结合缓冲液），在此浓度下非特异性的杂蛋白能从柱上洗脱下来，而与Ni2+特异性结合的目标蛋白不会被洗脱。最后用更高咪唑浓度的缓冲液（洗脱缓冲液）将目标蛋白洗脱下来，此时目标蛋白特异性的存在于该咪唑浓度的洗脱液中，从而得到纯化了的目标蛋白质。.1重组蛋白的诱导（1）载体构建：本实验采用pET-28a（+）表达载体，克隆受体菌为E.coliDH5α，表达宿主为E.coliBL21(DE3)。具体操作参考基因克隆与转化部分。（2）挑一个转化重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中（含100μg/m卡那霉素和），于37℃（3）取1ml过夜培养物，转接于100ml含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养1.5～2（4）在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2mM，按照预先建立的最佳表达条件进行诱导表达。（5）1200rpm，离心2min，收集菌体。（6）弃上清，向沉淀中加入500mlStartingbuffer（20mM磷酸缓冲液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mMNaCl，10%甘油，pH7.0），充分悬浮洗涤菌体。（7）12000rpm，离心2min，收集菌体。（8）向沉淀中加入15ml的startingbuffer，重悬菌体。（9）冰浴条件下超声波处理3min，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％，处理时以不发生气泡，不过热为准，以菌液变清晰为终止标准。（10）12000rpm，4℃离心20min，将上清移到干净灭过菌的50mlSDS分析蛋白的表达情况。若目的蛋白分布在上清中，继续进行下面的纯化操作。.2目标蛋白的体外纯化（1）灌制好Ni2+-NTA亲和层析柱，用去离子水进行缓慢洗脱，避免在柱床中引入气泡。（2）用10倍柱床体积的startingbuffer进行预平衡，上样，将细胞破碎后的上清液注入Ni2+-NTA亲和层析柱中。（3）用10倍ml的startingbuffer进行漂洗，收集滤过液。（4）开始用5倍柱床体积的含20mM咪唑的startingbuffer进行洗脱，并对洗脱液进行收集。（5）依次用5倍柱床体积的含40mM，60mM，80mM，100mM，200mM，300mM和500mM咪唑的startingbuffer进行洗脱，分别对洗脱液进行收集。（6）通过SDS检测回收的效果，确定咪唑最合适洗脱浓度。（7）从每管收集的滤出液取出10μl的样品，加入10μl的2XSDS凝胶加样缓冲液，摇匀。（8）沸水浴处理3min。（9）取出样品，将10μl样品全部上样于适当浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。【注意事项】（1）样品可贮存于4℃（2）用考马斯亮蓝或银染液进行染色，检测重组蛋白的纯化程度，并找到咪唑最合适洗脱浓度，也就是纯化蛋白含量最多的一管洗脱液所对应的浓度；并将该纯化出来的蛋白质经过PD-10柱子以去掉溶液中的咪唑。（3）蛋白质被洗脱完成之后，要及时地清洗柱子，使柱子能重复使用。（4）在下次对同一蛋白的纯化过程中，即可根据胶图所显示的个洗脱液中蛋白浓度的情况来优化整个洗脱过程。蛋白质溶液的去盐处理（使用PD-10去盐柱）（1）用10ml的startingbuffer平衡PD-10去盐柱。（2）上样：往PD-10去盐柱中加入2.5ml的蛋白质溶液。（3）用10ml的startingbuffer去洗PD-10去盐柱，开始收集滤出液，每1ml收集一管。离心管应该先在冰上预冷。（4）电泳检测重组蛋白质的纯化程度。（5）具体方法和过程与上面步骤一致。（6）选择合适的纯化蛋白样品，加入1倍体积的预冷甘油。接着将蛋白质样品置于－80℃【注意】PD-10去盐柱可以多次反复使用，但是不能使柱子变干，保存时应该用相应的缓冲液浸泡，并且置于4℃图1：PD-10去盐柱除去盐离子示意图（载自AmershamBiosciences产品说明）.3His-tagNOTE（1）若His标签蛋白没有结合，请依次检查：可能原因1：样品或者是结合缓冲液不正确。策略：检测pH及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。可能原因2：组氨酸的标签没有完全的暴露。策略：在变性条件下(用4～8M脲，或4～6M盐酸胍)进行纯化。可能原因3：HIS标签丢失。策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达，上游构建，改变his-tag的位置(C-terminalorN-terminal)，必要时增加his个数(常用6～10个)；策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。（2）若没有洗脱下来，请依次检查：可能原因1：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）。策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH来找出最佳的洗脱条件。可能原因2：降低PH的方法洗脱的，因为若PH低于3.5，会导致镍离子脱落。策略：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。可能原因3：蛋白已沉淀在柱上。策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4～8M脲，或4～6M盐酸胍)。可能原因4：非特异性疏水或其他相互反应。策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%TritonX-100）或增加NaCl的浓度。（3）HIS标签蛋白洗脱后杂带较多，什么原因?如何优化?高纯度的蛋白是纯化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS，所以经常会出现HIS标签蛋白洗脱后有一些杂带，可能的原因和优化的方法如下：可能原因1：蛋白酶部分降解了标签蛋白。策略：请添加蛋白酶抑制剂，（慎用EDTA）。可能原因2：杂质对镍离子有更高的亲和性。策略1：咪唑浓度必须优化，以确保高纯度（宿主细胞蛋白质的低结合）和高产率（组氨酸标记的目标蛋白质的强结合）之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度；在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑；咪唑的梯度不大（20个或更多的柱床体积），可能分离出有相似结合强度的蛋白。策略2：筛选最适合的缓冲液条件，NaCl浓度，PH的范围都需要进行筛选，以便决定最适的结合和洗脱条件。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成几个不同的混合配方。可能原因3：杂质和标签蛋白结合在一起。策略：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂；增加去垢剂的浓度，（2%TritonX-100or2%Tween20）；或者在washbuffer中增加甘油的浓度（50%）减少非特异性的相互反应；考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子可能原因4：洗涤不充分。策略：增加洗涤的次数,使洗涤充分。.4NTA树脂的再生NTA树脂在使用若干次数（3～5次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。注意：NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。用户需要自行准备25%，50%，75%，100%（v/v）乙醇和去离子水。NTA再生步骤：（1）从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的0.2MAceticAcid/6MgμanidineHCl洗。（2）用2倍体积的去离子水洗。（3）用3倍体积的2%SDS洗。（4）用1倍体积的25%乙醇洗。（5）用1倍体积的50%乙醇洗。（6）用1倍体积的75%乙醇洗。（7）用5倍体积的100%乙醇洗。（8）用1倍体积的75%乙醇洗。（9）用1倍体积的50%乙醇洗。（10）用1倍体积的25%乙醇洗。（11）用1倍体积的去离子水洗。（12）用5倍体积的0.1MEDTApH8.0洗。（13）用3倍体积的去离子水洗。（14）如果立即使用，用5倍体积的100mMNiSO4.6H2O洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0buffer或GμNTA-0buffer）洗。（15）如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4度保存，使用前需要执行步骤14。GST亲和标签的纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）是继组氨酸之后的第二个应用最多的重组蛋白标记。GST融合于目标蛋白的N端，可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。由于GST对底物还原性谷胱甘肽的亲和力是亚摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。用1ml的树脂纯化1L的大肠杆菌培养物可得到的目的蛋白产率为0.1～6.0mg。GST亲和纯化融合蛋白主要包括结合，洗涤，洗脱三个步骤，全过程只需要一到两种缓冲液，可以大量纯化，也可以小量的实现快速纯化。非常适合实验室小量制备大肠杆菌重组蛋白。下面以克隆到表达载体pGEX-6p-1上的GFP表达纯化为例，介绍一种小量快速的纯化方法，供大家参考。蛋白的诱导与样品的制备方法基本同上。.1GST亲和标签纯化的使用（1）从4℃冷柜中取出GlμtathioneSepharose4B（本产品购置GE公司，储存于20%乙醇，树脂的量和20%乙醇1：1（2）用宽嘴吸头吸取1ml的脂浆，加入到装有40ml的PBS(整个操作过程所有的PB均需预冷)V型离心管中，轻柔颠倒数次，洗涤除去残留的20%乙醇，2000rpm，离心5min，小心倾倒出PBS。（3）将破碎后的上清加入平衡上一步骤中的树脂中，轻轻混匀，4℃振荡温育，500rpm，1h，期间不断混匀，防止树脂沉淀，保GST-GFP（4）2000rpm，离心5min，小心倾倒出上清。（5）向沉淀中加入约40ml的PBS，轻柔混匀，振荡温育10min，2000rpm，离心5min，小心倾倒出上清。（6）重复步骤（5）一次，然后向沉淀中加入5ml的PBS悬浮树脂，并将悬浮液转移到一个10ml的塑料层析柱，并打开阀门放掉PBS。（7）洗脱收集目的蛋白。根据实验需要不同有两种方法来收集目的蛋白。方法一：是不切除GST-tag，可以向（6）中的树脂中加入1～2ml的洗脱缓冲液（50mMTris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽（GSH），pH8.0），轻轻混匀然后4℃温育10min，收集流出液，即为GST-GFP方法二：是纯化不含GST-tag的蛋白，按照说明书将蛋白酶PreScissionProtease（GE公司）用PBS稀释到到1ml，加入到（6）中的树脂中，轻轻混匀然后4℃温育12h，收集流出液，即为GFP（8）SDS分析纯化的蛋白。可以对操作过程中的每一步取样进行SDS分析。.2GlμtathioneSepharose4B再生GST•Bind树脂可以重复使用数次而无需再生。但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往会造成流速和结合载量都下降。为了去除结合在树脂上的蛋白，可以用10倍体积的50mMTris-HCl，0.5MNaCl，pH8.0洗树脂，接着用10倍体积的100mM醋酸钠pH4.5，0.5MNaCl再洗一次。其它可以选用做去除污染蛋白的缓冲液还包括：6M尿素，6M盐酸胍或低极性溶剂，如50～70%乙醇或50%乙二醇。任何上述处理后应该立即用10倍柱体积1XGSTBind/Washbuffer平衡。树脂可以在4℃下，20%乙醇/80%.3GST使用过程中可能的问题与对策（1）目标蛋白结合效率低结合条件不对：仔细核对各种溶液、缓冲液的成分和pH。低于pH6.5或高于pH8时，融合蛋白与GST•Bind树脂会结合不充分。确保树脂在与细胞裂解液结合前经过pH6.5～8.0缓冲液（如1XGSTBind/Washbuffer，PBS）的平衡细胞裂解前加入DTT会显著改善某些GST融合蛋白与GSTBind树脂的结合GST融合蛋白被超声打断降解：过度超声会破坏带标签的蛋白而减少其与树脂的结合。采用温和的超声条件或改用其它的破碎方法。蛋白的折叠问题：GST标签不能够正确的折叠难以结合GSH的底物。（2）蛋白难以洗脱洗脱体积太少：有时需要使用更多的缓冲液洗脱目的蛋白。洗脱缓冲液不新鲜：10XGST洗脱缓冲液－20℃下可以稳定存放6个月，最多耐受5次冻融。每次在临纯化前新鲜配制1X洗脱缓冲液中谷胱甘肽浓度太低：GST•Bind树脂的还原型谷胱甘肽浓度达到10mM就够了。但是洗脱时需要的还原型谷胱甘肽的浓度需要达到75mM。（3）纯化的蛋白杂质很多表达的蛋白不完整：再遇到一些稀有密码子或者特殊的RNA的二级结构时，可能使得目标蛋白截短表达，可采用一些特殊的表达宿主，如Rosetta系列。洗涤体积不够：增加洗脱量。洗脱条件：可已在洗脱缓冲液中加入一定量的非离子去污剂，如0.1%的Triton-100或NP-40等。也可以尝试提高洗脱时NaCl的浓度，以降低非特一性的结合。操作过程中目标蛋白降解：控制操作条件，比如严格4℃超声处理过度：减少超声，避免发泡导致蛋白变性。过度超声还会增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白共纯化共价共纯化：胶上有些多出来的条带是共纯化的促进蛋白正确折叠的分子伴侣，如：DnaK（70kDa），DnaJ（37kDa），GrpE（40kDa），GroEL（57kDa），和GroES（10kDa），再进行一次纯化可以改善。

MBP亲和标签的纯化原理：pMAL™系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP）的大肠杆菌malE基因，其下游的多克隆位点便于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白。通过“tac”强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达，并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化。此系统的pMAL载体含有LacZα基因，目的基因的插入导致其失活，通过X-gal平板可进行蓝白斑筛选。pMAL载体都含有一段编码蛋白酶识别位点的序列，融合蛋白纯化后，通过FactorXa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTMI（G）可将目的蛋白与MBP切割分离。pMALTM-c2系列载体缺失malE信号序列，导致融合蛋白在细胞质中表达。pMAL-p2系列载体含有malE信号序列，它可引导融合蛋白穿过胞质膜，进入周质。所有这些载体都含有一段编码蛋白酶识别位点的序列，融合蛋白纯化后，通过FactorXa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTMI（G）可将目的蛋白与MBP切割分离。Amylose树脂预装柱是一亲和基质，用来分离与麦芽糖结合蛋白融合的目的蛋白。结合容量：每毫升柱床体积可结合3.0mgMBP-Paramyosin融合蛋白。贮存：本品预膨胀在20%的乙醇中，4°过柱缓冲液：20mMTris-HCl，pH7.4，200mMNaCl，1mMEDTA。添加剂：1mMsodiμmazide；10mMβ－mercaptoethanol或1mMDTT。洗脱缓冲液：过柱缓冲液+10mM麦芽糖实验步骤：（1）重组质粒的构建，转化，融合蛋白的诱导表达和细胞破碎同上。（2）融合蛋白的亲和纯化：预装柱用8～12倍柱床体积的双蒸水冲洗；预装柱用9倍柱床体积过柱缓冲液平衡；将上述实验步骤三的上清液加入到柱床内，控制流速0.5～1ml/min（建议每次上样2～4ml）。用12倍柱床体积的过柱缓冲液淋洗未结合蛋白，每次用6ml，共4次。用4倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱与Amylose树脂结合的MBP融合蛋白，控制流速约0.5～1ml/min。收集3～5管样品洗脱液，收集体积为1ml/每管。通常，含目的蛋白的融合蛋白在一个柱床体积内将被洗脱下来，可以通过波长为280nm的紫外吸收光或考马斯亮蓝蛋白检测法进行检测。SDS检测洗脱样品*。再生。每次纯化蛋白完毕后，需要及时对Amylose树脂进行再生。Amylose树脂可以采用下述清洗步骤进行再生水3倍柱床体积0.1%SDS3倍柱床体积水1倍柱床体积过柱缓冲液3倍柱床体积【注意事项】（1）每次使用时，请先打开顶端的帽子再移去底部的帽子，以避免气泡进入到预装柱内。（2）在使用本预装柱时，请使用经过脱气后的缓冲液，以避免产生气泡。（3）预装柱在每次使用完毕后，在柱床上方加入2～4ml缓冲液或水，盖上顶端的帽子后，随即盖上底部的帽子，竖立放置于4℃（4）长期贮存时应贮存在含0.02％叠氮钠的缓冲液中或20％乙醇中，以避免染菌。【pMAL系统的优势】（1）75%的蛋白可获得高效表达，蛋白产量可达100mg/L（2）与其他几种常用表达系统研究比较，与MBP融合表达更能提高E.coli表达蛋白的可溶性。（3）采用麦芽糖温和洗脱：无去污剂或变性剂对蛋白活性的影响。（4）可在细胞质或周质中表达（pMAL-p2X载体）：周质表达可提高二硫键的形成，促进蛋白折叠的形成。8.5目的蛋白的后处理目的蛋白的浓缩蛋白的浓缩液是蛋白纯化过程中常用的操作，常用的方法有：（1）透析袋浓缩法利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6000～12000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30～40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。（2）冷冻干燥浓缩法这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。（3）超滤膜浓缩法此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤。另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。（4）凝胶浓缩法选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。蛋白质的定量定量作为生物实验室的日常工作之一，具有非常重要的意义。在生物学相关的研究中，无论是对蛋白质表达谱的定量比较还是蛋白质理化性质的分析，都建立在准确的定量这一基础之上。蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。（1）直接紫外吸收法由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，所以任何一个蛋白质都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，我们可以对其进行定量。紫外吸收法测定蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。但该法存在无法弥补的缺陷。首先，对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。其次，若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正。（2）Bradford法目前，实验室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法进行测定蛋白质含量。其原理为，蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。测定时一般用牛血清白蛋白作为标准品。该法测定要求样品中不能有能与考马斯亮蓝G-250反应显色的去污剂，比如Triton、NP-400、吐温等。与具体操作可参考相关试剂盒说明书。（3）Lorry法其原理是蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。具体操作可参考相关试剂盒说明书。一般而言，紫外吸收法适合于与色谱柱联用，达到实时监控，然而较不准确。Bradford法适合于大规模测定样品，但是样品中不能含有太高浓度的去污剂，对样品的要求较高。改良的Lorry法不再排斥去污剂，相对的操作就比较复杂。我们需要在试验中按照要求选用不同的定量方法。目前后两种常用的定量方法都有相关的试剂盒采用。蛋白的保存纯化的蛋白往往需要在一定的保存条件，以保证目标蛋白的稳定，避免活性丧失。蛋白溶液的保存原则：（1）缓冲液pH避免接近蛋白的等电点；（2）根据每次使用的量分装成多管，这样可避免反复冻融；（3）加入稳定剂如甘油，DTT,TritonX-100等。具体操作根据实验需要和蛋白特性，多数蛋白都可以加入终浓度为50%的甘油后－80℃绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27.0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。实验一质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA的纯化。细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严谨型质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH），质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。3、质粒DNA的提纯对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA，SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。三、实验材料、仪器及试剂1.在含有pEGFP－N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mLLB培养基的试管中。摇晃过夜。在含有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。2、使用仪器恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱四、实验步骤取1.5mlDH5α培养液倒入1.5mLeppendorf管中,13000rpm离心1min。重复1。弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。菌体沉淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置10min。加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5min。加入150μL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离心5min。上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀,13000rpm离心2min。将水相移入干净eppendorf管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀,13000rpm离心2min。将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于室温下2min，然后13000rpm离心5min。弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL70％乙醇洗沉淀一次,振荡混匀后，13000rpm离心5min。吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。将沉淀溶于30μLTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mLRNaseA)中，保存在-20℃按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在-20℃五、实验结果实验二质粒DNA浓度的测定一、实验目的学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。二、基本原理核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度（mg/ml），并通过测定与280nm和230nm的比值，估算DNA的纯度。三、实验材料与仪器1、实验材料pEGFP－N3和pET-28aDNA2.使用仪器Eppendorf核酸蛋白测定仪，移液枪四、实验步骤按下Eppendorf核酸蛋白测定仪dsDNA，比色皿中加入100μlddH2O，blank空白对照。取一0.5ml离心管，吸取质粒DNA5μl，然后再加入95μlddH2O，混匀。将100μl的溶液转移到比色皿中，注意不要出现气泡。按下sample，记录260nm下DNA的浓度（mg/ml）。并同时记录OD260nm/280nm，OD260nm/230nm的比值，估测DNA的纯度。计算质粒DNA母液的浓度=OD260nm下的浓度×20（mg/ml），DNA的纯度：OD260nm/280nm=1.8±0.1(如果低于1.7，说明样品中蛋白质去除的不完全，或样品中有苯酚的污染；如果高于1.9，说明样品中RNA去除的不完全。)OD260nm/230nm〉2.0实验三琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化DNA片段的比较方便、省时的技术：琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。二、基本原理影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（1）DNA分子的大小双链DNA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖浓度给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。（3）DNA的构象超螺旋环状（Ⅰ型）、切口环状（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和Ⅰ型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，Ⅰ型DNA比Ⅲ型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。（4）所用的电压低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kbDNA片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。（5）电泳缓冲液DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时（如10×buffer），电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。三、实验材料、仪器及试剂1、实验材料质粒DNA2、使用仪器核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪四、实验步骤1%琼脂糖凝胶的配制（1）加20ml1×TBE缓冲液于三角瓶中，（2）精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，（3）冷却至60℃（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上，（5）将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，（6）取5μl质粒DNA及2μlGeneFinder混匀上样（7）50-100v约电泳0.5-1小时（8）蓝盾可见光透射仪观察结果。五、实验结果实验四酶切及连接1.实验目的学习使用限制型内切酶进行DNA酶切的原理和方法。2.实验原理迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↓G-5’II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoRI、HindIII、BamHI和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC；HindIII识别AAGCTT5’-G↓AATTC3’-CTTAA↓G5’5’-GG↓CC3’-CC↓GG-5DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5ligaseligase53533.实验材料、仪器及试剂3.1实验材料pEGFP－N3和pET-28aDNA3.2仪器准备水浴锅、移液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、蓝盾可见光透射仪、凝胶成像仪3.3试剂BamHI(10U/μL)(TaKaRa公司);NotI(10U/μL)(TaKaRa公司),T4ligase4.操作步骤4.1酶切按如下双酶切体系（30μL）混合：反应物（μL）pEGFP-N3pET-28a质粒1818BamHI22NotI2210×bufferK330.1%BSA缓冲液33离心10s，混匀。37℃配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶30ml。适当放置冷却，45℃待凝胶凝固好以后，拨下梳子。酶切样品中加入5µl溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。1×TBEBuffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min。荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况，并照像。4.2回收酶切产物（采用天为时代DNA回收试剂盒进行回收）配30mL1％进口琼脂糖凝胶，尽量长一些（用粗梳子），对酶切产物进行电泳分离；将酶切产物全部加入加样孔中跑胶，观察结果，并且拍照。用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。以0.1g凝胶对应300μL的体积加入PN。50℃水浴放置10min将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，13000rpm离心60s，弃掉废液。加入800μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。加入500μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB30μL，洗脱缓冲液先在65℃水浴预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min置于－20℃4.3连接按照连接体系进行，16℃反应物体积/μL回收纯化的pET-28a质粒5gfp基因片段12T4连接酶1缓冲液（10×）2实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点，以及质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。二、基本原理外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。感受态指细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。大肠杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在0℃下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5×106-2×107个转化克隆子/μg超螺旋质粒DNA。制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37℃三.实验材料、仪器1.实验材料DH5α，BL21，pET-28a重组质粒DNA使用仪器水浴锅，高压灭菌锅、移液器、超净工作台、离心机、振荡培养箱，制冰机四、操作步骤1.LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）氨苄青霉素和卡那霉素等抗生素不抗热，如果培养基温度过高，容易导致抗生素失效，应使培养基降温至60℃左右后，再加入抗生素。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气泡。75mm2．感受态细胞的制备(CaCl2法)挑一大肠杆菌单菌落放入3mlLB液体培养基（含Kan+），37℃活化大肠杆菌：取3ml新鲜的LB液体培养基加入50-150μl的过夜菌，培养2-3个小时。将昨夜摇出来的DH5α或BL21培养液转入离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下4000rpm离心5min弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞,冰上放置20min,4℃下4000rpm离心5min弃去上清,加入300μL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置5min,即成感受态细胞悬液，可-80℃3.转化涂板（1）取2个无菌离心管，分别加入100μLDH5α感受态细胞悬液，第1管加5μl无菌水，第2管加入质粒DNA溶液5μl,轻轻摇匀,冰上放置30min。（2）42℃水浴中热激90s,热激后迅速置于冰上冷却5min（3）分别向管中加入100μLLB液体培养基,混匀后在37℃振荡培养30min（4）从管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,从管2中取50μL和100μL涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约10分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养20KanKanKanKanKan管1管1管2管2管1管1管2管250μL50μL50μL100μL实验六重组质粒DNA的鉴定（双酶切法和菌落PCR法）一、实验目的掌握双酶切法鉴定重组质粒DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR法鉴定重组质粒DNA的基本原理。了解菌落PCR法鉴定菌落及保存的操作方法。二、基本原理重组质粒DNA是利用限制性内切酶（如BamHI和NotI）分别酶切基因片段和质粒后，利用基因片段和质粒DNA一端带有相同的粘性末端连接起来的重组质粒，如果再利用相同的限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点，通过酶切下的重组片段的大小与连接的基因片段大小是否相同判断质粒DNA是否为重组质粒。单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板从5’具体地说，PCR反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定DNA聚合酶（Taq酶），脱氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与发展都有深远的影响。因此，PCR技术产生的时间虽不长，却以惊人的速度广泛地应用于分子生物学的各个领域。它可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。三、实验材料、仪器及试剂1.实验材料pET-28a重组质粒DNA或菌落2.使用仪器PCR仪，掌中宝离心机，冰箱，小型混合器，电泳槽和电泳仪，1.5ml离心管，移液器及吸头，蓝盾可见光透射仪，恒温培养箱3.试剂BamHI(10U/μL)(TaKaRa公司);NotI(10U/μL)(TaKaRa公司)四、实验步骤双酶切法随机挑取2个单菌落，接种，37℃质粒DNA的提取（碱裂解法）。双酶切鉴定体系(10μl)。反应物(μl)管1管2质粒DNA22BamHI0.50.5XhoI0.50.510×bufferK11ddH2O/μl66室温酶切2.5-3h。配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶20ml。酶切样品中加入5µl溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。1×TBEBuffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min。荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况，并照像。并确定最终的阳性克隆菌落PCR法挑取菌落随机挑取5个菌落。首先使用无菌枪头挑取菌落，在已准备好的含有卡那抗菌素，分好区的固体培养基中轻划一下（为保菌种），然后将余下菌置于eppendorf管中（作为PCR反应模板）。PCR反应体系（20μl）反应物体积/dNTP（10mM）2左引物0.5右引物0.5Taq酶（5U/μL）0.5MgCl2(25mM)1.210×Buffer2ddH2O13.3PCR循环：95℃5min（95℃60s；58℃60s；72℃72℃10minPCR产物的检测PCR产物加入5μl溴酚蓝-GeneFinder混合液，分别按编号加入DNA琼脂糖凝胶电泳的加样孔，使用1%琼脂糖电泳分离。用荧光激发器看结果，确定阳性克隆的位置。五、实验结果实验七GFP蛋白的诱导表达一、实验目的掌握用IPTG诱导GFP基因表达的基本原理及基本操作步骤。二、实验原理IPTG（异丙基硫代β-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点（MCS），GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。LacI基因编码调节蛋白，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达。IPTG可与四聚体调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。接着BL21编码的T7RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达。三、实验材料和仪器1.实验材料BL21，pET-28a重组质粒DNA2.使用仪器离心机，冰箱，小型混合器，移液器，恒温培养箱，手持式紫外灯，超净工作台。四、实验步骤取阳性克隆质粒DNA转化BL21；在含有Kan＋的固体培养基上，37℃培养20h挑取单菌落，37℃取4支无菌带盖试管，加入新鲜LB液体培养基（含有Kan＋）5ml，按1：20稀释比例加入过夜菌，37℃加入IPTG（1：1000）至终浓度1mmol/L，分别诱导0h，1h，2h，4h。分别取1.5ml，10000rpm离心5min，去除上清，收集沉淀，再重复一次收集沉淀。分别取IPTG诱导培养液20μl涂布在含Kan＋的固体培养基上，37℃观察蛋白表达用紫外线照射菌体沉淀及培养平板，可以看到绿色荧光。分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相，保存照片。实验八兔肝RNA的制备及测定1.实验目的学习从兔肝中提取RNA的原理和方法。通过紫外吸收法测定RNA的含量。利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。2.实验原理细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。一般1克动物组织约含有1毫克RNA，植物材料含量低些。其中大部分为rRNA（绝大部分约18S和28S），15%tRNA，只有1-5%左右为mRNA。动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富。经组织匀浆用苯酚处理并