蛋白折叠及折叠中间体的研究

提纲开展本项研究的意义当前相关研究综述几种常用的预测方法我们的研究兴趣与思路虚拟实验室1当前第1页\共有57页\编于星期三\15点1研究概述蛋白质是生命的重要分子，几乎在所有的生物学过程中都扮演着重要的角色。因此，关于其结构与功能方面的研究一直是人们关注的焦点。蛋白质生物功能的关键在于其空间构象，一个伸展开来或随机排布的肽链是没有生物活性的。虽然X射线晶体学和NMR技术是蛋白质结构测定的有效手段，但却远远跟不上飞速发展的DNA测序，它使得蛋白质氨基酸序列的信息以爆炸的方式增长，由此迫切需要直接由蛋白质的氨基酸序列出发进行高级结构的预测。目前，对一定氨基酸序列的多肽链折叠形成特定空间结构蛋白质的机制了解甚少。虽然已经发展了多种经验和理论的计算方法预测蛋白质结构，并取得了某些成功，但总体来说仍是一个尚未解决的难题。

2当前第2页\共有57页\编于星期三\15点

...Scientifically,thefoldingofaproteininall-atomdetailisaholygrailofmoderncomputationalbiology

...

-VijayPande,StanfordUniversity3当前第3页\共有57页\编于星期三\15点蛋白质的4级结构一级结构（Primary）-氨基酸序列二级结构（Secondary）-螺旋（alphahelix）-片层（betasheet）-盘绕（旋转）三级结构（Tertiary）-3D构象四级结构（Quaternary）-多肽链组合4当前第4页\共有57页\编于星期三\15点了解3D结构的重要意义帮助我们了解蛋白质序列和结构之间的关系帮助我们了解蛋白质结构和功能之间的关系帮助我们发现新药物和改进药物的设计5当前第5页\共有57页\编于星期三\15点影响3D结构的几个要素氨基酸的物理化学性质氨基酸的相对位置二面角的限制性氨基酸的亲水、疏水性局部二级结构倾向内部稳定化因子氢键,二硫键,盐桥6当前第6页\共有57页\编于星期三\15点蛋白质结构的实验测定X-ray晶体衍射需要生长蛋白质晶体（这对一部分蛋白质几乎是不可能的，总之，不容易）衍射图样能进行反傅立叶变换来表征电子密度（这有“相”的问题）核磁共振谱（NMR）

能提供距离约束，但很难发现对应的结构只适用于相对较小的蛋白质7当前第7页\共有57页\编于星期三\15点蛋白质结构的理论预测晶体衍射（X-ray）和核磁共振（NMR）实验所获得的结构数据远远满足不了需要在人体蛋白中，只有3571

个可在PDB数据库中找到30-50%的读码框（OpenReadingFrames）无法找到已知同源相似物理论预测可以用于结构相似性研究，进而有助于蛋白质功能分析8当前第8页\共有57页\编于星期三\15点溶液中的蛋白质是一个受到各种力作用的原子系统：化学键力、氢键力、库仑力、范德华力等。在适当的条件下，这些作用力将促使几乎任意初始构形的蛋白质折叠成为稳定的、良好定义的3D结构（nativestate）（在毫秒到秒的时间量级）。这是蛋白质3D结构abinitio（denovo）预测的基础。9当前第9页\共有57页\编于星期三\15点另一方面，经过百万年的演变，蛋白质形成了一族类，具有相似的序列、相似的结构、以及相关的功能。这是蛋白质结构预测的另一类方法－同源性比较方法的基础。10当前第10页\共有57页\编于星期三\15点蛋白质结构的理论预测11当前第11页\共有57页\编于星期三\15点结构预测的基本要求

要求优先度难度精确性55快速3－42－3自我校正42－3一致性42程序易用性2－3212当前第12页\共有57页\编于星期三\15点2相关研究综述（分子动力学，MD）蛋白质结构预测蛋白质的折叠－解折叠蛋白质－配体识别酶核酸（DNA,RNA）水化（溶剂化）生物膜双分子脂质层离子通道13当前第13页\共有57页\编于星期三\15点蛋白质的结构预测溶液中，蛋白质是一个受到各种力作用的原子系统：化学键力、氢键力、库仑力、范德华力等。在这个综合力场中，运用分子动力学（MD）模拟，得到蛋白质分子的各种可能构象（轨迹）。通过对各种可能构象进行全局自由能最小搜索，预测蛋白质的3D结构。特点：建立在物理原理（定律）的基础上。仅从蛋白质的氨基酸序列出发。不依赖模型化序列与任何已知结构在折叠水平上的相似性。14当前第14页\共有57页\编于星期三\15点1－40A多肽，水溶液，沿着优化的过渡路径的结构变化，从折叠的线圈（coil）结构到-螺旋结构15当前第15页\共有57页\编于星期三\15点1－40A多肽，水溶液，沿着优化的过渡路径的结构变化，从折叠的线圈状态到折叠的-片层目标构型16当前第16页\共有57页\编于星期三\15点蛋白质的折叠－解折叠关于蛋白质热变性的解折叠过程的MD模拟研究表明：解折叠的总体路径与温度无关。温度升高，只不过过程加速。折叠的过程与解折叠过程有直接的关系。这两点与以往的认识截然不同。理由：模拟观测到的再折叠（refolding）过程正好与在高温解折叠模拟中所观察到的相反。17当前第17页\共有57页\编于星期三\15点一些蛋白质的本性结构（N）和过渡态结构（TS）的MD模拟结果18当前第18页\共有57页\编于星期三\15点溶菌酶解折叠过程的MD模拟，经过了一系列的中间态（I），这些不同于螺旋的填充（packing）。D表示变性体。19当前第19页\共有57页\编于星期三\15点通过MD模拟Barnase的解折叠过程反过来研究其可能的折叠路径。D表示变性体。20当前第20页\共有57页\编于星期三\15点蛋白质－配体识别蛋白质－配体识别与生物分子的自由能模拟得益于一些重要方法的改进（和计算机能力的提高）。分子识别的研究能够帮助人们理解超出相互作用本身所涉及的更多信息，是对实验研究的重要补充。Poisson-Boltzmann静电模型提供了一个较快又较简单的自由能模拟方法，这种情况下静电相互作用是主要的。研究了天冬氨酸

tRNA合成酶对氨基酸的识别，这些特征对于保持遗传密码的完整性是非常重要的。21当前第21页\共有57页\编于星期三\15点Asp和Asn对天冬氨酸tRNA合成酶（AspRS）成键的热力学循环成键自由能变化的计算有两种方法ΔΔG=ΔG1－ΔG2（Alchemical）ΔΔG=ΔG4－ΔG3（Chemical）22当前第22页\共有57页\编于星期三\15点蛋白质－配体间相互作用以力场能为基础来确定配体与蛋白质之间的相互作用和热力学构象所进行的简单自由能计算在配体结构设计方面是非常有用的工具。线性相互作用能方法计算配体键自由能的MD模拟。优势：在配合物中仅仅考虑配体之间的相互作用就可确定键合能。应用在leadoptimization方面有前景蛋白质之间的相互作用离子通道23当前第23页\共有57页\编于星期三\15点酶MD模拟正在引导我们对酶的生物活性有一个更深入的了解。模拟可以告诉我们反应物（配体）是如何从酶的表面运动到内藏的活性部位的，以及这种运动的逼真图像。提出了酶活性调节的可能模式。基本通道瓶颈的张合运动影响反应物与活性中心的键合。动力学选择性：酶在正常状态下瓶颈的张合可能不会明显影响与反应物的键合，但较大的反应物分子可能会在有一个足够大的张开前即由于扩散而逃走。动力学选择性可能代表生物分子识别中的一种更普遍的现象。24当前第24页\共有57页\编于星期三\15点乙酰胆碱酯酶（AChE），配体到达活性部位的几率由基本通道（喉）颈宽度的波动所控制。也可能在很短暂的时间内活性部位和蛋白质表面会出现一个第二通道（后门）。25当前第25页\共有57页\编于星期三\15点AChE通道（喉）“开”与“关”的构象比较（模拟结果）。Ser203位于活性中心。26当前第26页\共有57页\编于星期三\15点核酸（DNA,RNA）核酸的MD模拟，数皮秒的时间标度。可以获取核酸序列以及各种溶剂条件对结构和分子的运动的影响信息。大到象tRNA这样的分子。在非常详细的层面上跟踪构型变化的过程。核酸形成的大的生物分子配合物研究。时间尺度提升至数百皮秒。全溶剂化的核酸系统的分子模拟已逐步面向实际体系。算法的改进已使得高度变化的核酸体系的精确MD模拟成为可能。更复杂的反应，如RNA催化及折叠等，仍依赖于更强大的计算机。27当前第27页\共有57页\编于星期三\15点ApA二聚体的自由能、基础角、可到达表面积对反应坐标作图ApA的堆叠构型28当前第28页\共有57页\编于星期三\15点水化（溶剂化）描述生物大分子周围的溶剂（水）分子分布。V.Makarov等人从实验、理论和模拟等方面综述了这一领域近5年的研究进展。结论大多数情况下，生物大分子在溶剂中不仅仅是一般的溶解，在与周围水分子的作用方式上，局域水化模式下水分子的分布更加切合实际，而不同于游离的水分子。在溶液中，局域化的水分子往往是与大分子缔合在一起的。描述了接近DNA和蛋白质分子表面的界面溶剂分子的结构（分布）。29当前第29页\共有57页\编于星期三\15点抹香鲸肌红蛋白的水化水化位置（蓝，实验），水化数密度最大值（黄，MD模拟）30当前第30页\共有57页\编于星期三\15点肌红蛋白周围溶剂数的3D密度分布，由MD轨迹切片计算得到。溶剂密度由肌红蛋白的平均结构覆盖。等密度线：0.005（蓝），0.01（绿），0.02（黄），0.035（红）（a）由模拟结果得到（b）由模型预测31当前第31页\共有57页\编于星期三\15点由MD模拟得到的DNA周围的溶剂化密度。最大值（实线）和最小值（虚线）黄点为X射线分析结果。二者符合良好。32当前第32页\共有57页\编于星期三\15点生物膜与双分子脂质层最近10年，计算机模拟已经深入到能够认识生物膜性质的水平，包括DNA与脂质体的相互作用、形成微孔的跨膜肽对脂质体环境的影响、以及挥发性麻醉分子的分配等。这些模拟中，所有的原子都是受限在小于10nm的空间内，这个模型搭起了全原子细节与介观区域之间的桥梁。以磷脂体中的麻醉剂分子为例进行了研究。DNA与脂质体混合物作为重要的生物物质，是因为它们是基因的携带者。33当前第33页\共有57页\编于星期三\15点MD模拟5.5ns后DMPC（中性脂质体）/DMTAP（阳离子脂质体）与DNA的联合体构型。（a）垂直于DNA轴（b）平行于DNA轴。DNA和脂质体的“头”P、N用球表示，“尾（疏水链）”用棍表示。各原子的颜色：N,蓝色；O,红色；P,黄色;C（DNA）,灰色；C（脂质体）,绿色；H,暗灰色。34当前第34页\共有57页\编于星期三\15点形成微孔的跨膜肽对脂质体环境的影响。5_M2-DMPC的构型。MD模拟2ns后。脂质体分子用球和棍表示。头端的N和P原子用蓝色和黄色的球表示。各原子的颜色：M2螺旋的N,蓝色；O,红色；C,灰色；S,黄色。35当前第35页\共有57页\编于星期三\15点两种麻醉剂分子进入双磷脂层的分配情况。MD模拟2ns后的构型。水分子和SDPC用球棍模型表示，脂质体中的N和P原子表示为蓝色和绿色的球。F,黄色；Cl,亮绿色；Br,暗绿色；H,灰色。36当前第36页\共有57页\编于星期三\15点离子通道离子通道允许无机金属离子选择性地穿过膜脂质层。通过基于原子模型和外部溶剂与膜脂质体之间的微观相互作用的MD模拟，使我们得以窥探到这类复杂体系的内部过程，允许人们在微观水平上观察离子的渗入（透过）。在过去的近十年中，随着计算方法的改进，短杆菌肽A离子通道的模拟研究从较简单的仅含有蛋白质和少数水分子的模型过渡到复杂的含有大的生物分子和脂质体的体系。现在，用真实的原子模型来模拟一些重要的生物通道几乎是比较常规的工作，如：Escherichiacoliporin的OmpFporin,机械敏感通道MscL,Streptomyceslividans的KcsAK+通道。37当前第37页\共有57页\编于星期三\15点MD模拟中的被2个Na＋离子占据的短杆菌肽A通道38当前第38页\共有57页\编于星期三\15点短杆菌肽A通道在50皮秒时间间隔内沿MD轨迹的5个构形的叠合图39当前第39页\共有57页\编于星期三\15点3几种常用的预测方法Abinitio

预测不依赖已知结构的同源相似物信息，直接预测一个序列对应的蛋白质三级结构（3D构象）线段模型（Threading）通过研究同已知线段序列的吻合度得到结构信息同源性（Homology）建模根据序列同源性分析、调整已知结构进行结构预测40当前第40页\共有57页\编于星期三\15点比较成功的工具和技术Abinitio

预测Rosetta,RAMPThreading3D-PSSM,PhD,123D

Homology建模Modeller,SWISS-MODEL41当前第41页\共有57页\编于星期三\15点几种abinitio

预测方法分析分子动力学模拟基于格子的方法基于局域模型的方法理论难点：缺少精确的势能函数构形空间太大，缺少有效的能量最小化计算策略

42当前第42页\共有57页\编于星期三\15点分子动力学模拟优点“真正的”abinitio

预测实时的动力学信息良好的理论基础缺点耗时，计算成本高对大分子溶液中势函数的研究不足

43当前第43页\共有57页\编于星期三\15点基于格子模型的方法格子模型（Latticemodels）用格子作为蛋白质的建造单位Ising模型离散态偏离格子模型（DiscreteStateOff-LatticeModels）允许氨基酸拥有有限的运动自由度44当前第44页\共有57页\编于星期三\15点基于格子模型的方法优点物理图像简单降低了计算复杂度缺点无法描述复杂的空间结构分辨率低于格子大小，限制了研究的精确度45当前第45页\共有57页\编于星期三\15点基于局域模型的方法局域预测方法（NarrowingthesearchwithLocalStructurePrediction）片段可以独立地进行折叠折叠的细节依赖于上下文序列成功应用DavidBaker等的Rosetta46当前第46页\共有57页\编于星期三\15点基于局域模型的方法如运用神经网络模型、决策树模型等机器学习算法来提高计算效率优点计算速度快精度高结合了

Homology方法的优点缺点非实时信息物理图像不明显47当前第47页\共有57页\编于星期三\15点通过机器学习提高效率基于神经网络的方法SilvioTosatto等基于决策树模型的方法ShawnM.Douglas等基于SVM的方法Xu等（PROSPECT）48当前第48页\共有57页\编于星期三\15点CASP竞赛

CriticalAssessmentofStructurePrediction94年起每两年进行一次分为三类对已知蛋白质结构进行预测,abinitio,homology,folding,etc.部分自动与全自动方法发表大量相关信息、评价和展望预测结果逐年得到改进49当前第49页\共有57页\编于星期三\15点Rosetta的预测结果

左侧为实测结构，右侧为预测结构50当前第50页\共有57页\编于星期三\15点Rosetta对T0116262-322

的预测结果实际预测51当前第51页\共有57页\编于星期三\15点Abinitio

预测发展趋势更高的预测精度（大于60%－70%）更加自动化的预测，尽量减少人为的干预与其他方法相结合52当前第52页\共有57页\编于星期三\15点4我们的思路－鸡尾酒方法

（Semi-abinitio

方法）分子动力学模拟优点：实时;良好的理论基础缺点：计算成本高;精确度不够高基于模型的方法优点：计算速度快;精确度高缺点：不实时;物理图像不够明确53当前第53页\共有57页\编于星期三\15点Semi-