细胞转染试剂产品销售专员培训资料详解演示文稿

细胞转染试剂产品销售专员培训资料详解演示文稿当前第1页\共有68页\编于星期四\7点（优选）细胞转染试剂产品销售专员培训资料当前第2页\共有68页\编于星期四\7点

转染的应用：基因组功能研究：基因表达调控，蛋白功能，信号转导和药物筛选研究建立细胞系：转基因细胞模型、永生性细胞株建立转基因动物模型基因治疗研究和应用蛋白功能和定位研究重组蛋白生产及蛋白药物研究当前第3页\共有68页\编于星期四\7点Whydoweneedtransfectionreagent?DNA:highlyanionicandhydrophilicmacromoleculeNoionicinteraction++++++++++Cationicmacromolecule++++++CationicReagentMembrane:anionicandhydrophobic----------HeparanSulfateProteoglycanes当前第4页\共有68页\编于星期四\7点细胞转染难易比较Adherent>Suspension Problem: E.g.:MembraneTHP1,Jurkat…Fastdividingcell>nondividingcell Problem: E.g.:AccesstothenucleusNeurons,…Cellline>Primarycell Problem: E.g.:MoresensitiveEpithelialprimarycells…体外转染当前第5页\共有68页\编于星期四\7点PolyPlus-transfection是法国一家专门致力于研发和销售转染试剂的生物技术公司PolyPlus-transfection公司简介

PolyPlus-transfection提供体内和体外转染产品，包括基因、寡核苷酸、siRNA及蛋白转染产品，可进行瞬时和稳定的转染及重组蛋白质制备。当前第6页\共有68页\编于星期四\7点第一部分产品介绍当前第7页\共有68页\编于星期四\7点InVitroInVivosiRNAtransfectionStandardtransfectionINTERFERin™jetSI™-ENDOTraffickingandvisualizationjetSI™-FluojetSI™-ENDO-Fluo产品介绍DNAtransfectionStandardtransfection

invivo-jetPEI™Ligand-conjugatedreagents

invivo-jetPEI™-Galinvivo-jetPEI™-ManTraffickingandvisualization

invivo-jetPEI™-Fluoinvivo-jetPEI™-biotinDNAtransfectionInvitroInvivoStandardtransfection

jetPEI™Cell-specifictransfectionjetPEI™-GaljetPEI™-MacrophagejetPEI™-HUVECjetPEI™-RGDTraffickingandvisualization

jetPEI™-FluojetPEI™-biotinSyntheticmediumtransfectionFecturin™ProteindeliveryProteinandantibody

PULSin™invivo-jetPEI™MousebraininjectionjetSI™10mMsiRNAtransfection当前第8页\共有68页\编于星期四\7点产品系列

Protein&antibody转染

------PULSinSiRNA体外转染

------INTERFERin

DNA&SiRNA体内转染------invivojetPEIDNA体外转染

------invitrojetPEI当前第9页\共有68页\编于星期四\7点产品系列一Protein&antibody转染:-------PULSin蛋白转染当前第10页\共有68页\编于星期四\7点Protein&antibody转染应用：细胞内定位研究蛋白水平的干扰研究抗体功能封闭的研究疾病治疗的研究替代免疫细胞化学在活细胞内检测蛋白转染当前第11页\共有68页\编于星期四\7点protein转染难题

MassChargePurityStability3DstructureReleaseActivityxkDapI=xx%hoursordaysGlobular,random,well-definedstructureFreeproteinincytoplasmDNAandRNA=anionicpolymersProtein=morecomplexmolecules蛋白转染当前第12页\共有68页\编于星期四\7点技术原理PULSin™:

cationicamphiphilic-basedformulation蛋白转染当前第13页\共有68页\编于星期四\7点操作步骤21For24-wellplate:细胞融合度：70-80%稀释蛋白：1µgofprotein/100µlHepes1加4µl

PULSin™2孵育15min3洗细胞，加900µl无血清培养基4加protein/PULSin复合物345孵育4h5更换新鲜完全培养基6分析蛋白活性或检测6蛋白转染当前第14页\共有68页\编于星期四\7点R-phycoerythrinNIH-3T3cellsConditions:Livingcellswereanalyzedbyfluorescencemicroscopy16hourspost-delivery.pI=5.5MW=240kDaPULSin转染蛋白质1µgR-PE + + -

4µlPULSin™

+ - -DiffusefluorescenceEfficientdeliveryofproteinwithPULSin™蛋白转染当前第15页\共有68页\编于星期四\7点PULSin™转染单抗HeLacellsanti-NPC-(AF®488)1µlAb4µlPULSin™Conditions:Livingcellswereanalyzedbyfluorescencemicroscopy8hourspost-delivery.LocalizedfluorescencearoundnuclearmembraneEfficientdeliveryoffunctionalAb抗体转染当前第16页\共有68页\编于星期四\7点PULSin™转染多抗HeLacellsanti-giantin-(AF®488)0.5µlAb4µlPULSin™Conditions:Livingcellswereanalyzedbyconfocalmicroscopy17hourspost-delivery.PlasmamembraneswerestainedwithConcanavalinA-rhodamine.EfficientdeliveryoffunctionalAb抗体转染

当前第17页\共有68页\编于星期四\7点PULSin™转染多肽多肽转染HeLacellsConditions:DeliveryofPep-A(StreptococcusTPEBepitope,),intoHeLacells.ComplexeswereformedwithPep-A(1µg,lissamine-rhodaminederivative,Sigma)andPULSin™(4µl).Observationwascarriedout16hpost-delivery.Pep-A(StreptococcusTPEBepitope)16aa，lissamine-rhodaminederivativeEfficientdeliveryofPeptides当前第18页\共有68页\编于星期四\7点PULSin™已转染的不同细胞类型R-PE:1µg/PULSin™:4µlDeliverytoawidevarietyofcells蛋白转染当前第19页\共有68页\编于星期四\7点PULSin™已转染的细胞及转染效率蛋白转染R-phycoerythrinR-phycoerythrinR-phycoerythrin当前第20页\共有68页\编于星期四\7点PULSin™:蛋白/抗体/多肽列表蛋白转染当前第21页\共有68页\编于星期四\7点优势：

新新技术——活细胞中进行Protein/Ab转染高转染效率

无细胞毒性

即用型溶液

操作简单PULSin™优势蛋白转染当前第22页\共有68页\编于星期四\7点PULSin™的竞争对手蛋白转染Chariot

(ActiveMotif)BioPorter(GTS)ProteoJuice(Merck)当前第23页\共有68页\编于星期四\7点产品系列二体外SiRNA转染:-------INTERFERinsiRNA转染当前第24页\共有68页\编于星期四\7点选择、设计、合成siRNA双链化学合成siRNA质粒表达siRNA转染siRNA到靶细胞瞬时表达——化学合成siRNA，质粒表达siRNA稳定表达——质粒表达siRNA分析检测RNA干扰作用蛋白水平:WB/IF/FCmRNA水平:实时定量RT-PCR，northernblottingsiRNA基因沉默实验设计当前第25页\共有68页\编于星期四\7点iRNA介导基因沉默机制

siRNAsiRNAexpressionplasmidCleavagebyDicersiRNAssiRNAassociatewithRISCCleavageofmRNAbyRISCRISCdsRNADicercleavageofdsRNAHairpinsiRNACellmembraneNuclearmembraneProteinXINTERFERin™jetPEI™siRNA转染当前第26页\共有68页\编于星期四\7点实验操作

siRNA(1nM)inserum-freemedium1AddINTERFERin™Vortexandincubate10minatr.t.31234AddtowellcontainingcellsincompletemediumIncubatefor48hoursat37°C56Genesilencingassay6542Protocolforcellsin24-wellplateINTERFERin™siRNA转染当前第27页\共有68页\编于星期四\7点反向操作——HTS操作

StandartprotocolReverseprotocolPlatecells24hpriortotransfectionDilutesiRNAsAddINTERFERin™VortexIncubate10minDistributeintowellsDistributesiRNAsoruselibrariesAddINTERFERin™MixIncubate10minAddcells96-wellplateDay1Day2Day1Day3PlateTransfectAssayPlateandtransfectDay4AssaysiRNA转染当前第28页\共有68页\编于星期四\7点反向转染基因沉默效率

A549-GL3LucLuciferase96-wellplate反向转染仍能得到极高的基因沉默效率siRNA转染当前第29页\共有68页\编于星期四\7点siRNAdeliverywithINTERFERin™

CaSkicells(24-wellplate)LaminA/CImmunofluorescenceassay1nMsiRNAsiRNA转染基因沉默效率当前第30页\共有68页\编于星期四\7点基因沉默效率GreatsilencingdowntopicomolarsiRNAconcentration

A549-GL3Luccells(24-wellplate)Luciferase70%92%siRNA转染当前第31页\共有68页\编于星期四\7点细胞毒性

A549-GL3Luc(24-wellplate)1nMsiRNANocellulartoxicityobservedwithINTERFERin™L1INTERFERin™L2siRNA转染当前第32页\共有68页\编于星期四\7点成功转染的细胞系SilencingefficiencywithINTERFERin™invariouscelllinessiRNA转染当前第33页\共有68页\编于星期四\7点原代细胞的高效沉默

24-wellplateGAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)BranchedDNAassay96%人原代肝实质细胞人原代纤维原细胞82%siRNA转染当前第34页\共有68页\编于星期四\7点INTERFERin优势低浓度siRNA（甚至pmol级别）就能达到高效的基因沉默在很多细胞系中，基因沉默效率可达到90％以上在原代细胞中也能达到有效的基因沉默效率无细胞毒性不受血清和抗生素的影响操作简单价格便宜在反向操作转染中的效率高siRNA转染当前第35页\共有68页\编于星期四\7点siRNA转染竞争对手Lipofectamine2000（Invitrogen）Oligofectamine（Invitrogen）HiPerFect（Qiagen）SiLentFect（BioRad）

Invitrogenisthelargest

siRNAtransfectionmarketQiagenisadangerousoutsiderwithHiPerFectsiRNA转染当前第36页\共有68页\编于星期四\7点INTERFERinvsLipofectamine2000当前第37页\共有68页\编于星期四\7点INTERFERin

vs

Oligofectamine当前第38页\共有68页\编于星期四\7点INTERFERin

vsHiPerFect/SiLentFect当前第39页\共有68页\编于星期四\7点INTERFERin™与HiPerFect/SiLentFect

基因沉默效率

A549-GL3Luc(24-wellplate)Luciferase当前第40页\共有68页\编于星期四\7点INTERFERin™与HiPerFect/SiLentFect

细胞毒性

A549-GL3Luc(24-wellplate)1nMsiRNANocellulartoxicityobservedwithINTERFERin™HiPerFectINTERFERin™SiLentFect™当前第41页\共有68页\编于星期四\7点体内DNA&siRNA转染:

------invivojetPEI产品系列三体内转染当前第42页\共有68页\编于星期四\7点invivojetPEI

vs

VirusesinvivojetPEI:easytobeusednotimmunogenicnottoxiccandeliveredoligonucleotidesuptoverylargeDNA… …butalsosiRNA体内转染当前第43页\共有68页\编于星期四\7点Efficiency/specificity++++++++++Virusin

vivo-jetPEI™genesize(kbp)3-30>400YesnoneImmuneresponseYes(L2–L3)noneLabrequirement体内转染invivojetPEIvsViruses当前第44页\共有68页\编于星期四\7点DifferentroutesVariousanimals

Intravenous静脉Intratumoral瘤内Intracerebral脑室Intraperitonal腹膜Intratracheal气管灌注Instillation…吸入MouseRatDuckGuineapigMonkey…体内转染的路径和动物…towardsHumanapplication体内转染当前第45页\共有68页\编于星期四\7点体内转染的基因表达分布情况O.Freund活小鼠体内荧光素酶表达的荧光检测图象（用含50µgpCMVluc和invivo-jetPEI复合物的400µl5%葡萄糖溶液尾部注射Balb/Cmice）

Liver30000Tumor2000KidneyL300000LungR20000000KidneyR115000OvaryL210000LungL16000000OvaryR150000CourtesyJL.CollandO.Freundinvivo-jetPEI体内转染体内转染当前第46页\共有68页\编于星期四\7点InRatsH19-DTA（H19-白喉毒素A基因）质粒与invivo-jetPEI复合物转入大鼠膀胱。

NBT-IIcells 50µgDNAatD+4&D+8 D+11ratsweresacrified

Ohana,P.,etal.GeneTherMolBiol(2004)8,181-192DecreaseinbladderweightInhibitionoftumorgrowthinvivo-jetPEI转染对膀胱癌的治疗体内转染当前第47页\共有68页\编于星期四\7点InHumanH19-DTAplasmid/invivo-jetPEI™复合物转染对人膀胱癌的治疗Ohana,P.,etal.GeneTherMolBiol(2004)8,181-192(D)Video-cystoscopyperformedbeforethetreatmentandthreeweeksafterthecompletionofthe6thtreatment,showingalargenecroticareareplacingthetumorregion(E).Treatmentshows>75%tumorregressioninvivo-jetPEI转染对膀胱癌的治疗体内转染当前第48页\共有68页\编于星期四\7点活体小鼠尾静脉注射（24小时后的荧光检测图）24hourslater,theluciferasegeneexpressionwasmonitoredbybioluminescentimagingoflivemiceusingacooledCCDcamera.DNAalone(GL2-Luc)DNA(GL2-Luc)+GL2-Luc-siRNA,10µgDNA(GL2-Luc)+GL3-Luc-siRNA,10µgColl,Freund,Erbacherinvivo-jetPEI:DNA-siRNA共转染siRNAandpCMVLuc与invivo-jetPEI复合物转染对荧光素酶肺部表达起明显的抑制作用。体内转染当前第49页\共有68页\编于星期四\7点Urban-kleinetal.,GeneTherapy,1-6,2004C-erb2/neu(HER-2)receptorinvivo-jetPEI：--体内基因沉默HER-2downregulationTumorgrowthinhibitionduring18daysi.p.inathymicnudemiceSubcutaneoustumorxenograftsSKOV-3(ovariancarcinomacell)A)NakedHER-2specificsiRNA(0.6nmole)B)HER-2siRNA/PEIpolyplexes体内转染当前第50页\共有68页\编于星期四\7点产品系列四DNAinvitro

transfection:

------invitrojetPEI体外DNA转染当前第51页\共有68页\编于星期四\7点DNA转染过程体外DNA转染提取质粒DNA或寡核苷酸选择和培养细胞系转染瞬时转染稳定转染：抗性筛选检测外源基因细胞内表达的实验流程：当前第52页\共有68页\编于星期四\7点DNA转染试剂+H3NO+ONH3CCH3H3CDOTMA(Lipofectin®)MonocationiclipidsPolycationiclipids++NONOHNHNH3H2NTransfectam™CationicpolymersPAMAMDendrimerOHONHONHOH2NNHRNHRNHRnPolylysineandderivativesNNNNNNNNNNH2NNH2NH2NH2NH2NH2NH2H2NH2NH2NH2NNH2012GenerationsNHNNHNHNNHNNHNHNHNNH3+NHNHNNHNHNNNHNH2NH+3HN+3HNNH3+NH3+NH3+Polyethylenimine(PEI)体外DNA转染当前第53页\共有68页\编于星期四\7点polyethylenimine(PEI)NH=-CH2-CH2-NH-=43DaammoniumgroupsforDNAcondensationbufferingaminegroupsbranchedPEIlinearPEI1H+/amine3579pH0.5nnjetPEI™体外DNA转染当前第54页\共有68页\编于星期四\7点DNAjetPEICationiccomplexesnucleusProtonSpongecytoplasmEndocytosisinvitroDNAdelivery体外DNA转染NHHNOHnmHCl-H3C当前第55页\共有68页\编于星期四\7点jetPEI1µl=7.5nmolesofaminefunctionDNA1µg=3nmolesofphosphategroupnumber

of

nitrogen

residues

of

jetPEInumber

of

DNA

phosphates=NPComplexesFormation2µlofjetPEIfor1µgofDNAatN/P=5InvitroDNAdelivery当前第56页\共有68页\编于星期四\7点jetPEI™:实验操作+serum2µlofjetPEIfor1µgofDNA1mlofjetPEI=500transfectionsin24-wellplates or=2500transfectionsin96-wellplates体外DNA转染当前第57页\共有68页\编于星期四\7点HeLacells1µgofpCMVLuc,N/P5ComplexesFormationEffectofincubationtimeSameefficiency体外DNA转染当前第58页\共有68页\编于星期四\7点HeLaHEK293NIH3T3ß-galactosidaseBHKN/P=3N/P=5controlpCMVLacZReproductibilityCellstransfectedin24-wellplateswithjetPEI