浅论34株多重耐药铜绿假单胞菌的耐药性及β内酰胺酶基因分析

浅论34株多重耐药铜绿假单胞菌的耐药性及β内酰胺酶基因分析【摘要】目的：对34株多重耐药铜绿假单胞菌的药敏结果和β内酰胺酶基因进行分析，以指导临床合理用药。方法：用KB法对铜绿假单胞菌进行常规药敏试验，选取34株多重耐药铜绿假单胞菌，并用PCR扩增方法检测其β内酰胺酶基因：TEM，SHV，PER，VEB。结果：34株多重耐药铜绿假单胞菌对12种常用抗生素的耐药率为%～100%，PCR检测出TEM为%，SHV为%，VEB为%，PER为0%。结论：我院多重耐药铜绿假单胞菌携带的β内酰胺酶基因以TEM为主。

【关键词】铜绿假单胞菌；β内酰胺酶；多重耐药

［Abstract］Objective:ToinvestigatedrugresistancepatternandβlactamasegenicofmultidrugresistantPseudomonasaeruginosa,soastoprovidereferenceforreasonableselectionofantimicrobials.Methods：Antimicrobialsusceptibilitywasevaluatedbydiskdiffusiontest(KBmethod).Theβlactamasegenes:TEM,SHV,VEB,PERcarriedonmultidrugresistantPseudomonasaeruginosaweredetectedbypolymerasechainreactionmethod(PCR).Results：Theresistantratesof34strainsmultidrugPseudomonasaeruginosato12kindsofantimicrobialswerefrom%to100%.ThepositiverateofβlactamasegenesTEM,SHV,VEB,PERexpressionwas%(15/34),%(4/34),%(2/34),and0%.Conclusion：TEMtypeβlactamasewasthemaintypeofPseudomonasaeruginosageneinourhospital.

［Keywords］Pseudomonasaeruginosa;βlactamase;multidrugresistant

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)广泛分布于自然界，是临床常见的条件致病菌之一，常引起肺部、泌尿系及烧伤创面感染。近年来PA在医院感染分离菌的分离率居首位，其耐药率不断升高，对多种抗生素表现出固有或获得性耐药，对3类或3类以上抗菌药表现耐药的多重耐药(multidrugresistant，MDR)的PA不断增加［1-5］。为了使临床能有效控制感染，对多重耐药菌耐药特征的研究成了人们关注的热点。现对我院2005年1月～2007年12月间部分多重耐药PA的耐药性及β内酰胺酶基因进行分析，报告如下。

1材料和方法

材料

实验菌株的收集与筛选

收集2005年1月～2007年12月我院临床微生物科分离所得的PA，利用KB法筛选出多重耐药的菌株。根据NCCLS2005年标准进行敏感、中敏、耐药的判断，3类或3类以上抗菌药物耐药的菌株判为多重耐药PA。铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌。共收集了34株，其中痰标本19株、尿标本2株、其他标本13株。全部细菌用法国生物梅里埃公司API鉴定系统鉴定到种。

仪器和材料

温箱、低温冰箱、PCR扩增仪和电泳仪等。MullerHinton(MH)琼脂为OXOIDE公司产品。

抗菌药物纸片

氨曲南(ATM)、头孢吡肟(FEP)、头孢他啶(CAZ)、头孢哌酮/舒巴坦(SCF)、头孢哌酮、亚胺培南(IPM)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、妥布霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶(SXT)，均购自中国药品生物制品检定所。

方法

药敏

根据NCCLS2005年标准，用KB法对铜绿假单胞菌进行常规药敏试验。

PCR检测细菌β

内酰胺酶基因检测模板提取：挑纯培养细菌菌落少许置入50μl灭菌水中，置100℃水浴10min，8000r/min30s，上清液即为DNA模板液。

根据文献［6］和基因库检索，设计引物序列

TEMP1：5′GAGTATTCAACATTTCCGTGTC3′，

TEMP2：5′TAATCAGTGAGGCACCTATCTC3′，扩增产物为535bp；

SHVP1：5′TGGTTATGCGTTATATTCGCC3′，

SHVP2：5′GCTTAGCGTTGCCAGTGCT3′，扩增产物为865bp；

PERP1：5′ATGAATGTCATTATAAAAGC3′，

PERP2：5′AATTTGGGCTTAGGGCAGAA3′，扩增产物为978bp；

VEBP1：5′CGACTTCCATTTCCCGATGC3′，

VEBP2：5′GGACTCTGCAACAAATACGC3′，扩增产物为961bp。引物由上海生工生物工程公司合成。

反应体系为：10×PCR缓冲液μl，dNTP2μl，P1和P2各μl，TaqDNA聚合酶1U，扩增模板液μl，反应体系25μl。热循环参数为：94℃预变性5min，然后按94℃1min→55℃45s→72℃1min，共35个循环；取反应管内液体5μl与1μl电泳指示剂混匀，点样于%琼脂糖凝胶，以100V电压电泳30min后，EB染色，在紫外光下观察结果。

2结果

34株多重耐药PA药敏结果

34株多重耐药PA对12种常用药物的耐药率由%至100%，具体结果见表1。表134株多重耐药PA对12种常用药物的药敏结果

PCR结果

PCR结果显示，34株多重耐药PA中，TEM阳性为14株，阳性率为%；SHV阳性4株，阳性率％；VEB阳性2株，阳性率％；PER阳性率0％。其中有3株同时携带SHV和TEM基因。

3讨论

多重耐药PA感染是临床抗感染治疗的难点之一，根据对本院近年来分离到的PA药敏结果分析，3类或3类以上抗菌药物耐药的PA感染已呈上升趋势。从药敏结果中可以看到，34株多重耐药PA对12种临床常用抗生素的耐药率在%～100%，对β内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类均显示出较高的耐药性。第三代头孢中头孢他啶是经典的抗PA药物，但耐药菌株增加迅速，本研究显示其耐药率达到50%，亚胺培南的耐药率也达到了%，对一些常规药物几乎全部耐药，符合多重耐药的特征。

由于PA耐药率的不断升高，耐药机制复杂，以及细菌耐药存在区域性差异，对多重耐药菌耐药特征的研究成了人们关注的热点［7-9］。研究认为，PA对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制是产生β内酰胺酶和膜泵出系统的相互作用。β内酰胺酶是细菌产生的酶类,能够破坏渗透入菌体内的β内酰胺类抗生素的活性。β内酰胺酶种类很多，特性各样，按分子生物学分类，可以分为A～D4类［10，11］，除B类为金属酶外，其他3类的活性位点均为丝氨酸残基。本研究利用PCR方法检测了多重耐药PA携带的A类β内酰胺酶基因：TEM，SHV，PER，VEB。TEM和PER是由质粒介导的，携带TEM的PA对所有的抗假单胞菌的β内酰胺类和氨基糖苷类抗生素耐药，PER被认为是一组新的A类β内酰胺酶基因，决定可转移的对氧亚氨基头孢菌素、氨曲南的耐药性。结果显示，在34株多重耐药PA中，TEM的检出率达到了%，但没有检测出PER，说明我院的多重耐药PA携带的β内酰胺酶基因型以TEM为主。

SHV和VEB通常是由转坐子或整合子介导的，常在其他肠杆菌科的细菌中检出。本组34株多重耐药PA中，4株携带SHV基因，2株携带VEB基因，两者之间没有重叠。有3株同时携带SHV和TEM基因，说明PA可以同时携带多种β内酰胺酶基因，与其他文献报道相符［9］。

PA作为一种常见的条件致病菌，其耐药菌株有随着抗菌药物使用频率的增加而逐年增多的趋势。PA的耐药现状不容乐观，目前NCCLS/CLSI推荐的超广谱β内酰胺酶的表型初筛及确证实验不适合检测PA是否产ESBLs，用分子生物学的方法可以很好地分析PA中的耐药基因型，为临床工作者更好地控制PA感染和使用抗菌药物提供了依据，同时，也有利于加强实验室对院内感染菌的监控。

【参考文献】

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［4］DoiY,GhilardiR,AdamsJ,etal.Highprevalenceofmetalloβlactamaseand16SrRNAmethylasecoproductionamongimipenemresistantPseudomonasaeruginosaisolatesinBrazil［J］.AntimicrobAgentsChemother,2007,51(9):3388-3390.

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［8］常东,蒋伟,魏华，等.多重耐药铜绿假单胞菌产超广谱β内酰胺酶基因研究［J］.中华