细胞样品代谢产物提取

新一代靶向代谢组学测试细胞和培养液样品中代谢产物提取方法

李克峰博士实验背景和目的代谢(Metabolism)是维持生物体功能进行的各类生化反应的总称。代谢产物(Metabolites)是参与生物体内代谢的小分子化合物，其分子量一般在1200Da以下。代谢产物具有非常重要的功能，是基因、蛋白与环境作用的直接反应。新一代靶向代谢组学技术(Next-generationTargetedMetabolomics)是近几年随着检测仪器的更新，刚刚发展起来的代谢组学新技术，旨在测定生物体内所有小分子的代谢产物的绝对浓度，了解其在疾病(Diseases)、胁迫(Stresses)等条件下的变化，进而揭示表观现象后的分子机制。细胞样品，价格相对低廉，生长迅速，易于给予各种处理，是代谢组学研究常用的材料。实验需要准备的材料和器材提取液(100%的甲醇，加入315种13C稳定同位素内标物；提前放置-20°C冰箱预冷)碎冰或者冰盒细胞推刮器涡旋仪涡旋仪低温高速离心机(提前置于4°C预冷，配有1.5 ml离心管转子)低速临床离心机(配有15ml或者50ml离心管转子)SpeedVac/lyophilize或者氮吹干，或者在通风厨挥干移液枪、枪头、离心管、Marker笔、手套等细胞代谢产物的提取方法（时间大约40分钟）准确记录培养皿中的细胞数，一般靶向代谢组学测试至少需要有1百万细胞。❖为保证实验测试的准确性，至少保证每组6个平行重复（Replicates）o将细胞用细胞推刮器从培养皿底部刮起。连同培养基一起转移到50ml离心管中。❖根据液体的体积和离心机的转子大小，可以选择15ml离心管。⑷用低速离心机，常温离心10分钟（800g）。❖为防止细胞裂解，最好转速不超多1500g。离心完后，将上清液和细胞分开，低温保存，供靶向代谢组学测试用。❖细胞和细胞间的相互作用（Cell-CellCommunication）是通过其生长的培养基实现的，细胞在大多数条件下都是通过向培养基中分泌某些小分子的代谢产物，来应对各种的人为的处理。因此，请不要将上清液丢弃。上清液的代谢组学测试，可能得到意想不到的新的科学发现。将上清液和细胞分别做代谢产物提取。取上清液100微升，转移到1.5ml离心管中，加入400微升提取液（含13C稳定同位素标记的内标物），对于细胞，则直接向离心管中加入500微升提取液（含13C稳定同位素标记的内标物），将提取液转移到1.5ml离心管中。涡旋混匀，在冰上静置10分钟。高速低温离心（16000g,4度）10分钟❖至少10000g，以保证完全沉淀。❖此步骤的目的是沉淀蛋白质、DNA等大分子物质，小分子的代谢产物，则留在上清液中。

[10]将离心完后的上清液转移到新的离心管中，标记好编号，低温保存，供代谢组学分析测试用。根据仪器性能，如果仪器灵敏度低的话，则需要进行第11步。[11]取200微升上清液，在液氮下催干，封口低温保存，供分析测试用>1millioncells(Maybecombineseveralplates)Atleast3-5replicatestoensurepublishableresults(N二3-5).,St叩3:细胞和培养液分别作代谢组学FrLr^t.取培养液了犬/、S1（上面培养液）液M/-80C冷冻终止醇反应吸走所有的剩余,St叩3:细胞和培养液分别作代谢组学FrLr^t.取培养液了犬/、S1（上面培养液）液M/-80C冷冻终止醇反应吸走所有的剩余焙养液'S2（底部细胞）T液氮/-80C拎冻终.止醇反应图1：简要的细胞收集步骤52（底部细胞）S152（底部细胞）100W加WODul100%甲醇上清为代i射产物.代谢组学用Votexandmix沉淀为大分子产翎整白、DNA.100W加WODul100%甲醇上清为代i射产物.代谢组学用Votexandmix沉淀为大分子产翎整白、DNA.pDlymer等）VctexandmixF.清为代谢产物,代谢组学用就淀为大分子产物（蚩白、DNA,polymer'^F）取辨口Hl上清液吹千编号标记.邮寄，顺便发送电子版样品绢号和分组，便于后期生物信息学分析处理桐号标记，邮寄.顺便发送电子版样品编号和分组’便于