粪大肠菌群计数步骤-个人详细介绍

/asphtml/GB071.htm/粪大肠菌群计数步骤GB/T4789.39-2008一、 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1恒温培养箱：36°C±1°C。2冰箱：2C〜5°C.3恒温水浴箱:44.5°C±0.2°C。4天平：感量0.1g。5均质器。6振荡器。7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。8无菌锥形瓶：容量500mL。9无菌培养皿：直径90mm。10pH计或pH比色管或精密pH试纸。二、 培养基及试剂1月桂基硫酸盐胰蛋白豚（laurylsulfatetryptose,LST）肉汤2EC肉汤（E.colibroth）3无菌生理盐水：称取8.5g氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121°C高压灭菌15min。44mol/L氢氧化钠（NaOH）:称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中51mol/L盐酸（HCl）:移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10样品匀液，或置225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1min~2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注人盛有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过巧min。6.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白豚（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤），36°C±1°C培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。6.3复发酵试验用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于45°CEC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放人带盖的44.5°C±0.2°C恒温水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群阳性，不产气为粪大肠菌群阴性。6.4粪大肠菌群MPN计数的报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表（见附录B），报告每克（或毫升）粪大肠菌群的MPN值。GB/T4789.39-2008粪大肠菌群计数培养基一、培养基明细：名称规格价格（元）月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）250g90EC肉汤250g90磷酸盐缓冲液（PH7.2）(PBS)250g80无菌生理盐水**1mol/l的NaOH**1mol/l的HCL**二、备注：1、粪大肠菌群一群在44.5°C培养24—48h能发酵乳酸、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群来自人和温血动物的粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。2、 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121°。高压灭菌15min。3、 1mol/l的NaOH:称取40gNaOH溶于1000ml的蒸馏水中4、 1mol/l的HCL：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释到1000ml

配方一各种动物需用的生理盐水哺乳类需用生理盐水浓度是0.9%。称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀