反向液相色谱的工作原理

谁能告知我一下反向液相色谱的工作原理吗？它与正向的有什么区分吗？高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液安排色谱法〔正相与反相〕、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。液固色谱法使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固定相对组分吸附铝，粒度5~10μm。适用于分别分子量200~1000子型化合物易产生拖尾。常用于分别同分异构体。液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体外表，或化学键合于担体外表而形成的固个安排平衡过程。承受。现在多承受的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流淌相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法承受极性固定相〔如聚乙二醇、氨基与腈基键合相〕；流淌相为相对非极性的疏水性溶剂〔烷烃类如正已烷、环已烷〕，常参与乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调整组分的保存时间。常用于分别中等极性和极性较强的化合物〔氨基酸类等〕。〔如C18C8〕和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应80%左右。易解离样品的分析。为把握样品在分析过程的解离，常用缓冲液把握流淌相的pH值。但需和C8使用的pHpH太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告商品柱可在pH1.5~10范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低流淌相极性低～中中～高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出〔如氨基键合固定相〕。离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在外表未端芳环上接上羧基、磺酸基〔称阳离子交换树脂〕或季氨基〔阴离子交换树脂〕。被分别组分在色谱柱上分别原理是树脂上可电离离子与流淌相中具有一样电荷的离子及被测组分的离子进展可逆交换，依据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分别。缓冲液常用作离子交换色谱的流淌相pHpH高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是依据被测组分别子与离果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱〔即C18〕，流淌相为甲醇-水或乙腈-水，水中参与3~10mmol/L的离子对试剂，在确定的pH值范围内进展分别。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流淌相组成及其pH值、离子强度有关。排阻色谱法固定相是有确定孔径的多孔性填料，流淌相是可以溶解样品的溶剂。小分分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。色谱法的根本原理利用样品混合物中各组分理、化性质的差异，各组分程度不同的安排到互不相溶的两相中。当两相相对运动时，各组分在两相中反复屡次重安排，结果使混合物得到分别。两相中，固定不动的一相称固定相；移动的一相称流淌相。分类：依据流淌相分—以气体作流淌相—气相色谱——固定相为液体气-液色谱-固色谱—以液体作流淌相—液相色谱——固定相为液体液-液色谱-固色谱—当流淌相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体时——超临界色谱依据固定相的附着方式—固定相装在圆柱管中—柱色谱—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄膜色谱〔平板色谱〕—液体固定相涂在纸上—纸色谱〔平板色谱〕依据分别机理—安排色谱—样品组分的安排系数不同—吸附色谱—样品组分对固定相外表吸附力不同—体积排阻色谱—利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开—离子交换色谱—不同离子与固定相商相反电荷间的作用力大小不同依据极性—流淌相极性＞固定相极性-反相色谱—流淌相极性＜固定相极性-正相色谱气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析所以，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。一、吸附色谱〔adsorptionchromatography〕又叫液固色谱法：流淌相是液体，固定相是固体。相竞争吸附中心。各组分的吸附力气不同，使组分在固定相中产生保存时间不同和实现分别。固定相：固定相通常是强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用。流淌相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃〔己烷、戊烷、庚烷等〕、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。应用：对于极性，构造异构体分别和族分别仍是最有效的方法，如农药异构体分别、石油中烷、烯、芳烃的分别。缺点是简洁产生不对称峰和拖尾现象。二、安排色谱原理：固定液机械的吸附在惰性载体上，样品分子依据他们在流淌相和固定相间的溶解度不同，分别进入两相安排而实现分别。固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。如全多孔微粒硅胶吸附剂。依据极性不同分类：正相安排色谱—固定相载体上涂布的是极性固定液；流淌相是非极性溶剂；可分立极性较强的水溶性样品；弱极性组分先洗脱出来。反相安排色谱—固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液；流淌相是极性溶剂；强极性组分先洗脱出来。液-液安排色谱固定相中的固定液体往往简洁溶解到流淌相中去，所以重现性很差，且不能进展梯度洗脱，已经不大为人们所承受。三、键合相色谱固定相惰性载体上，固定相就不会溶解到流淌相中去了。键合固定相优点：○对极性有机溶剂有良好的化学稳定性使色谱柱的柱效高、寿命长试验重现性好几乎适于各种类相的有机化合物的分别，尤其是k’宽范围的样品可以梯度洗脱依据极性不同分类：正相键合相色谱—固定相极性＞流淌相极性固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。适于分别脂荣、水溶性的极性、强极性化合物反相键合相色谱—固定相极性＜流淌相极性固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表，其极性很小。适于分别非机性、弱极性离子型样品，是当今液相色谱的最主要分别模式。正相HPLC〔normalphaseHPLC〕：是由极性固定相和非极性〔或弱极性〕流淌相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流淌相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC〔reversedphaseHPLC〕：由非极性固定相和极性流淌相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱，OctaDecyltrichloroSilane)，代表性的流淌相是甲醇和乙腈。四、体积排阻色谱〔SEC，sizeexclusionchromatograghy〕〔又称凝胶色谱和分子筛色谱〕原理：以多孔凝胶〔如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等〕作固定相，依据样品分子量大小到达分别目 的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大局部凝胶孔洞， 在柱中被强滞留，后被洗脱。依据样品性质分类：凝胶过滤〔GFC〕—用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。凝胶渗透〔GPC〕—用于分析脂溶性样品，如测定高聚