大肠系统表达及纯化操作指南

大肠系统小量表达蛋白的操作指南19：001.5mlLB〔K+〕液体培育基中〔试管中〕，37200rpm培育。2OD=0.6~0.8，IPTG诱导〔3ulIPTG/支试管〕，37200rpm2h。351.5mlEP1ml13000rpm，离心1min130~100ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液吹散〔参与缓冲液的量视菌体量而定〕，2×溴酚蓝Buffer，1005min4400ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕15520200W，13000rpm10min50ulEP管，加50ul2×Buffer，1005min50ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕50ul2×Buffer，100℃煮5min，电泳。大肠系统大量表达操作指南〔方案一〕110：0010ul1~2mlLB〔K+〕液体培育基中，37℃，200rpm2， 17：001~2ul250mlLB〔K+〕液体培育基37℃，200rpm，过夜培育。39：00250mlLB〔K+〕液体培育37℃，200rpmOD=0.6~0.8，IPTG诱导〔125ulIPTG/250ml菌液〕，2h后收菌。451.5mlEP1ml菌液，13000rpm1min150ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕50ul2×Buffer，1005min4400ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕1管中，超5520200W13000rpm，离心550ml12023rpm2min。弃上清，沉淀用20~30ml10mMTris-HCl〔pH8.0〕202050次，400W，13000rpm10min，依据小样超声的电泳结果打算留上清还是留沉淀〔包涵体〕大肠系统大量表达操作指南〔方案二〕10min50ulEP50ul2×Buffer，1005min50ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液吹50ul2×Buffer，1005min，电泳。117：0037℃，过夜培育，活化菌种。29：00415：00：挑一个单克隆接到5mlLB〔K+〕37200rpm，过夜培育。39：005ml250mlLB〔K+〕液体37℃，200rpmOD=0.6~0.8，IPTG诱导〔125ulIPTG/250ml菌液〕，2h后收菌。451.5mlEP1ml菌液，13000rpm1min150ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕50ul2×Buffer，1005min4550ml12023rpm2min。弃上清，沉淀用20~30ml10mMTris-HCl〔pH8.0〕202050次，400W，13000rpm10min，依据小样超声的电泳结果打算留上清还是留沉淀〔包涵体〕大肠系统大量表达操作指南〔方案二〕400ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕1管中，超5520200W，13000rpm10min50ulEP50ul2×Buffer，1005min，50ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液吹散，参与50ul2×Buffer，1005min，电泳。110：0010ul1~2mlLB〔K+〕液体培育基中，37℃，200rpm217：001~2ul5mlLB〔K+〕液体培育基37200rpm，过夜培育。39：005ml250mlLB〔K+〕液体37℃，200rpmOD=0.6~0.8，IPTG诱导〔125ulIPTG/250ml菌液〕，2h后收菌。451.5mlEP1ml13000rpm，550ml12023rpm2min。弃上清，沉淀用20~30ml10mMTris-HCl〔pH8.0〕202050次，400W，13000rpm10min，依据小样超声的电泳结果打算留上清还是留沉淀〔包涵体〕大肠系统大量表达操作指南〔方案三〕1min150ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液吹散50ul2×Buffer，1005min4支管的沉淀，共用400ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕15秒520200W，13000rpm10min50ul上清至EP50ul2×Buffer，1005min50ul10mMTris-HCl〔pH8.0〕50ul2×溴酚蓝Buffer，1005min，电泳。550ml12023rpm2min。弃上清，沉淀用20~30ml10mMTris-HCl〔pH8.0〕202050次，400W，13000rpm10min，依据小样超声的电泳结果打算留上清还是留沉淀〔包涵体〕大肠系统表达的包涵体蛋白小量预洗的操作指南1，20~30ml10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液重悬超声离心得到的沉淀〔500ml菌液所得〕，21mlEP13000rpm2min。弃上清。3，1.2mlBufferB 3h。4，13000rpm2min，弃上清〔50ul做电泳比照〕。5，1.2ml10mMTris-HCl〔pH8.0〕13000rpm，离心2min65一次。7，1.2ml2M10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液重悬沉淀，室温静置15min13000rpm2min，弃上清〔50ul做电泳比照〕。8，1.2ml10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液重悬沉淀9,8一次。10，1.2ml8M10mMTris-HCl〔pH8.0〕50ul小样电泳。大肠系统表达蛋白的大量洗涤的操作指南一、包涵体的纯化1，20~30ml10mMTris-HCl 〔pH8.0〕溶液重悬超声离心得到的沉淀〔500ml菌液所得〕，12023rpm，离心10min。弃上清。2，20~30mlBufferB 重悬沉淀，摇动或静置3h。312023rpm10min，上清转入另一管中保存〔50ul做电泳比照〕。4，20~30ml10mMTris-HCl 〔pH8.0〕12023rpm，离心10min54一次。6，20~30ml2M10mMTris-HCl〔pH8.0〕30min12023rpm10min，上清转入另一离心管中〔50ul做电泳比照〕。7，20~30ml10mMTris-HCl 〔pH8.0〕溶液重悬沉淀。87一次。91~2ml10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液重悬沉淀，再加5~10ml8M10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液重溶解沉淀〔先加5~10ml15~20ml〕，50ul小样电泳。10，上清和沉淀冷冻之前均需要加适量的甘油。BufferB含有：5%Triton50mMTris-HCl〔pH8.0〕50mM氯化钠5mMEDTA镍柱亲和层析1，填柱，留意不能有气泡。2pH7.0.〔7〕3pH2~3.〔7〕4pH7.0〔7〕5，10mMTris-HCl〔pH8.0〕80ml〔7〕。60.5M10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液平衡镍柱，约80~100ml。〔7〕7A0，T95.80.5M。留意流速要慢〔3~4〕。90.5M10mMTris-HCl〔pH8.0〕溶液洗OD很低且稳定。〔7〕10，15mM0.5M10mMTris-HCl〔pH8.0〕40ml〔0.5MNaCl10mMTris-HCl〔pH8.0〕1.5M0.4ml〕，洗脱，收集蛋白峰。〔7〕11，60mM0.5M10mMTris-HCl〔pH8.0〕40ml〔0.5MNaCl10mMTris-HCl〔pH8.0〕1.5M1.6ml〕，洗脱，收集蛋白峰。〔7〕12，300mM0.5M10mMTris-HCl〔pH8.0〕40ml〔0.5MNaCl10mMTris-HCl〔pH8.0〕1.5M8ml〕，洗脱，收集蛋白峰。〔7〕13，拆柱，处理填料。NiSepharose6FastFlow 非变性条件纯化蛋白Protocol一，NiSepharose6FastFlow 介质的预处理1，轻柔震荡，使介质均匀重悬。21.5ml混悬液〔1ml，〕/15ml离心管中，2500rpm5min，弃上清。35ml双蒸水/3min2500rpm5min，弃上清。45mlBufferB/3min，2500rpm5min，弃上清。54一次。61ml/BufferB2ml/50%品的纯化1，样品〔10mMTris-HCl 〔pH8.0〕体系〕溶液中参与咪唑和氯化钠，使中体系为10mMTris-HCl〔pH8.0〕,500mMNaCl,30mM 咪唑,pH8.0。12023rpm，离心10min50ul小样，电泳。2，样品溶液参与层析柱，收集流出液，留小样电泳。3，10mlBufferB 洗柱，分别接第1ml，第6ml和第10ml，电泳4，10mlBufferW 洗柱，分别接第1ml，第6ml和第10ml，电泳5，10mlBufferE 洗脱，每ml接一个EP管中，第1，2，3，4，7管电泳三，介质的清洗和再生15~10mlBufferS洗柱。25~10mlBufferB洗柱。3，5~10ml双蒸水洗柱。41.0ml0.1MNiSO 4过柱。5，5~10ml双蒸水洗柱。65~10mlBufferB 洗柱。BufferB〔Bindingbuffer〕:10mMTris-HCl 〔pH8.0〕,500mMNaCl,30mM 咪唑,pH8.0BufferW〔washbuffer〕:10mMTris-HCl 〔pH8.0〕,500mMNaCl,100mM 咪唑,pH8.0BufferE〔Elutionbuffer〕:10mMTris-HCl 〔pH8.0〕,500mMNaCl,300mM 咪唑,pH8.0BufferS〔strippingbuffer〕:10mMTris-HCl 〔pH8.0〕,500mMNaCl,50mMEDTA,pH8.0NiSepharose6FastFlow 变性条件纯Protocol一，NiSepharose6FastFlow 介质的预处理2，轻柔震荡，使介质均匀重悬。20.75ml混悬液〔0.5ml，〕/15ml离心管中，2500rpm5min，弃上清。33ml双蒸水/3min2500rpm5min，弃上清。43mlBufferB/3min，2500rpm5min，弃上清。54一次。60.5ml/BufferB1ml/50%的混悬液，装柱。二，包涵体样品的纯化11mlBufferB10~20ml含尿BufferB12023rpm10min50ul小样，电泳。23，5mlBufferB 洗柱，接第1ml，电泳4，5mlBufferW1 洗柱，接第1ml，电泳5，5mlBufferW2 洗柱，接第1ml，电泳6，5mlBufferE mlEP1，2，3，管电泳三，介质的清洗和再生15mlBufferS 洗柱。25mlBufferB 洗柱。3，5ml双蒸水洗柱。40.5ml0.1MNiSO 4过柱。5，5ml双蒸水洗柱。65mlBufferB 洗柱。BufferB〔Bindingbuffer〕:10mMTris-HCl 〔pH8.0〕,8M500mMNaCl,pH8.0BufferW1〔washbuffer1〕:10mMTris-HCl 〔pH8.0〕,8M