生化工程第七章固定化酶和细胞

1、酶分子构相的改变和载体屏障效应载体的存在引起屏蔽效应，使酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，从而影响固定化酶的活性。当前第1页\共有44页\编于星期四\4点2、微环境效应—分配效应

固定化酶处于主体溶液中，形成非均相反应系统。在固定化酶附近的环境称为微环境，而主体溶液则称为大环境。由于载体和底物的疏水性、亲水性以及静电作用，使微环境与大环境有不同的性质，从而形成底物和各种效应物的不均匀分布，这种效应称为分配效应。当前第2页\共有44页\编于星期四\4点3、扩散阻力

用固定化酶进行反应时，底物必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催化部位。反应后，产物又沿着相反路线从酶的催化部位传递到主体溶液。这些传递过程包括被动分子扩散和对流扩散，传递过程中存在着一个扩散速率限制问题。这种扩散限制效应在扩散效率很低时，而酶的催化活力又相当高时特别显著。当前第3页\共有44页\编于星期四\4点底物从反应液移向载体表面（外扩散）底物从载体表面移向酶活性中心（内扩散）酶反应产物由反应位点移向载体表面（内扩散）产物移到反应液中（外扩散）总的反应速度取决于最慢的步骤3、扩散阻力当前第4页\共有44页\编于星期四\4点3、扩散阻力限速步骤有可能是外扩散、内扩散或酶反应。存在的扩散效应会使固定化酶、固定化细胞的动力学行为偏离其液态下的动力学行为。当前第5页\共有44页\编于星期四\4点4、外扩散限制的分析及对酶反应动力学的影响

外扩散发生在固定化酶周围的处于停滞状态的液膜层。由于存在外扩散阻力，底物将在固定化酶周围形成浓度梯度。滞流层的厚度在一定限度内，它受固定化酶界面周围溶液的相对速度的影响。外扩散限制随反应体系搅拌速度的增加而减少。当前第6页\共有44页\编于星期四\4点4、外扩散限制的分析及对酶反应动力学的影响存在外扩散限制的固定化酶反应动力学方程为：

V=Vm=K·E，E为固定化酶浓度Km(app)：表观米氏常数在操作上使流体的湍动程度大，能改变或消除外扩散的影响。Vm·SS+Km(app)当前第7页\共有44页\编于星期四\4点5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响

内扩散阻力发生在多孔性固定化酶载体的内部，它是底物传递到固定化酶内部时的一种扩散限制效应。当前第8页\共有44页\编于星期四\4点5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响

在微环境内底物的消耗和产物的积累程度，也常和这些物质的分子量大小有关。

当前第9页\共有44页\编于星期四\4点5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响

大分子物质在多孔介质中扩散时，其扩散系数较小，以致在微环境中形成严重的底物枯竭和产物的大量积累，这会严重影响酶促反应速度。

当前第10页\共有44页\编于星期四\4点5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响

内扩散限制对酶促反应动力学的影响，比外扩散更为突出，因为外扩散限制可以通过搅拌来基本消除，而内扩散限制无法消除。在固定化酶、固定化细胞的内部，不存在流体流动，其传质完全依赖于分子被动扩散作用。定义η为有效系数：η==V有V无有微孔内扩散效应下的反应速度无微孔内扩散效应的反应速度当前第11页\共有44页\编于星期四\4点5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响固定化酶、细胞的反应速度：

V=ηVm·Sa/(Km+Sa)Sa：载体表面底物浓度η是与内扩散系数Φ有关的因子Φ=R√Vm/Km·Deη∝1/ΦR为固定化颗粒半径当前第12页\共有44页\编于星期四\4点8.4均相酶反应器

1、影响均相酶反应速度的因素，通常有下列三方面：（1）浓度因素:酶浓度底物浓度产物浓度浓度因素是所有影响因素中最基本的因素；是均相酶反应动力学的主要内容。当前第13页\共有44页\编于星期四\4点（2）外部反应环境因素是指反应环境中的温度、压力、pH以及溶剂的介电常数、离子强度等。（3）内部结构因素

是指底物和酶的结构。当前第14页\共有44页\编于星期四\4点2、酶反应器的设计原理及操作参数

为了设计酶反应器以及确定反应操作条件，首先必须了解：反应速度特性以及温度、pH等因素的影响，建立反应速率方程式；反应器的形式和反应器内流体流动状态以及传热特点；产物的产量和质量。当前第15页\共有44页\编于星期四\4点2、酶反应器的设计原理及操作参数通常，物料平衡、热量平衡、反应速率和流动特性等各关系式都可同时应用于反应器设计。参与反应的各组分均服从于质量守恒定律，这是设计的出发点。当前第16页\共有44页\编于星期四\4点表示反应器性能的重要操作参数：

空间时间、转化率和生产率；当有副反应发生时，选择率也是重要的参数。①空间时间（简称空时，spacetime）表示反应物在连续操作反应器内停留的时间。空时的倒数

称为空速(spacevelocity)。

当前第17页\共有44页\编于星期四\4点PFR:CSTR:：反应器容积(L)；

q：加入反应器的底物溶液体积流量。

当前第18页\共有44页\编于星期四\4点②转化率x，又称为反应率。表示加入反应器中底物的转化率。间歇操作:

S0:初始底物浓度；St:经反应时间t后的底物浓度

连续操作:Sin:流入反应器溶液中的底物浓度Sout:流出反应器溶液中的底物浓度当前第19页\共有44页\编于星期四\4点③生产率Pr（生产能力productivity）

指反应器单位体积单位时间内的产物生成量。间歇式反应器：Pr=pt/t,连续式反应器：Pr=pout/t.当前第20页\共有44页\编于星期四\4点式中asp代表1摩尔底物能生成目的产物P的理论量（摩尔），其数值取决于反应的计量式。④选择率Ssp(selectivity)当反应过程中有副反应发生，除生成目的产物外，还生成其它产物时，通常使用选择率这个概念。Ssp是指实际转化成目的产物量与全部底物可生成产物的理论量之比。当前第21页\共有44页\编于星期四\4点3、理想的均相酶反应器的动力学

对三种最基本的反应器型式进行讨论。间歇搅拌罐（BSTR）活塞流反应器（PFR）全混流反应器（CSTR）当前第22页\共有44页\编于星期四\4点当前第23页\共有44页\编于星期四\4点（1）PFR的操作特性方程物料在PFR反应器中的停留时间dlFFS0

S

dV=Adll=0l=LSS+dS以底物S进行物料衡算：流入量=流出量+反应量+积累量FSF（S+dS）-rsdV0当前第24页\共有44页\编于星期四\4点流入量=流出量+反应量+积累量FSF（S+dS）-rsdV0-FdS=-rsdV=-rsAdlτ=-∫

dS-rs-rs=将米氏方程代入当前第25页\共有44页\编于星期四\4点这是BSTR和PFR的酶反应动力学操作方程式。

在边界条件：

L=0，S=S0；l=L，s=S，积分：

得：当前第26页\共有44页\编于星期四\4点（2）CSTR的操作特性方程

稳态时，对于底物S进行整个反应器的物料衡算：流入量=流出量+反应量+积累量

FS0FSt

-rsV0FFS0

St

整理：-rs=将米氏方程代入当前第27页\共有44页\编于星期四\4点整理：CSTR操作特性方程为：当前第28页\共有44页\编于星期四\4点在工程上要求，在最短的操作时间内，用最少量的（固定化）酶，达到最大的产物生成量、最高的底物转化率，以使生产成本最低。(这些条件称之为反应器效率。)下面比较CSTR和PFR的反应器效率当前第29页\共有44页\编于星期四\4点（3）PFR和CSTR反应器的生产时间比较为了方便比较，把操作方程改写为：……CSTR

……PFR

当前第30页\共有44页\编于星期四\4点PFR和CSTR的生产时间比较x应在80﹪以上。达同样的转化率，F值差别很大。而且越小，差别越显著。

结论：PFR的停留时间小于CSTR的停留时间当前第31页\共有44页\编于星期四\4点…PFR

（4）PFR和CSTR反应器的用酶量比较

…CSTR

当前第32页\共有44页\编于星期四\4点转化率x愈高，

Km/S0

越小，用酶量的差别越大。反应器体积一定，达到相同转化率时，ECSTR/EPFR

与转化率的比较在给定的反应体系下，反应器中的装酶量为定值，达一定x下反应器所需酶量愈少，反应器的反应容量能力也就愈大。可见PFR的生产能力比CSTR的大。

当前第33页\共有44页\编于星期四\4点8.5固定化酶、固定化细胞反应器及动力学当前第34页\共有44页\编于星期四\4点当前第35页\共有44页\编于星期四\4点当前第36页\共有44页\编于星期四\4点当前第37页\共有44页\编于星期四\4点2、固定化酶、细胞反应器动力学固定化酶、固定化细胞反应器的动力学行为与理想酶反应器动力学不同。其主要原因是：（1）反应器中流体是非理想流动（2）固定化酶、固定化细胞反应中存在着扩散效应。

当前第38页\共有44页\编于星期四\4点（1）非理想反应器

PFR和CSTR是理想反应器的两个极端，实际的反应器物料流动状态介于平推流和全混流之间。偏离理想流动的原因是返混。实际应用中，对于接近PFR的反应器，用扩散模型来描述；对于接近STR型反应器，可将其视为多极STR串联起来的反应器处理。

CSTRPFR当前第39页\共有44页\编于星期四\4点（2）扩散效应

尽管动力学方程要求其中的参数应与过程发生的机制联系在一起，然而如果将固定化颗粒粒度、孔径等等都代入动力学方程，复杂程度会太大，所以从实用简单的角度出发，用表观米代常数Km(app)、表观最大速率Vmax(app)代替Km和Vm、或以有效系数乘之，就可如对待理想酶反应一样进行解析，这样即简洁又有用。

V=ηVm·Sa/(Km+Sa)，V=Vm·SS+Km(app)当前第40页\共有44页\编于星期四\4点3、固定化酶、固定化细胞反应器的操作稳定性

在使用期间，固定化酶、细胞的活性会下降，主要原因是：酶变性，细胞自消化；可能由于pH、T、毒物作用，该过程比较缓慢，而且底物往往有保护作用。吸附抑制物；染菌；酶、细胞流失；载体崩解；

当前第41页\共有44页\编于星期四\4点3、固定化酶、固定化细胞反应器的操作稳定性固定化酶稳定性通常用半衰期表示。半衰期指固定化酶、固定化细胞在使用中活性降低一半所经历的时间。当前第42页\共有44页\编于星期四\4点对稳定性影响最大的是操作温度。酶的恒温热失活速率服从一级反应动力学：3、固定化酶、固定化细胞反应器的操作稳定性-dEdt=Kd·E——底物对酶没有保护作用-dEdt=（）·EKdS——底物对酶有保护作用Kd：酶的热失活速率常数。