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文档简介
酶催化剂的优点:专一性强,反应条件温和,反应速度较快。弱点:溶液酶在反应后,分离困难,重复利用困难;溶液酶稳定性差,易失活。1969出现了固定化酶技术。固定化酶就是把原来游离的水溶性酶,设法限制或固定于某一局部的空间或者固定于载体上。当前第1页\共有24页\编于星期四\4点固定化酶生物反应器实际应用中,固定化酶可以装在反应器中,连续生产有利于生产的自动化,提高生产率。鉴于此,70年代以来,该技术受到各国学者的瞩目,纷纷开展固定化酶的研究。当前第2页\共有24页\编于星期四\4点8.1
固定化方法及固定化后酶和细胞的性质
一、固定化的原则和方法由于酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心。固定化时,活性中心的必需基团避免参加反应;避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐的处理,保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋白质的高级结构。尽可能在温和条件下进行固定化反应。当前第3页\共有24页\编于星期四\4点固定化方法:载体结合法:将酶(细胞)固定在不溶性载体上。靠共价结合、离子结合、和物理吸附。常用的载体:纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。载体结合法交联法包埋法8.1
固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质当前第4页\共有24页\编于星期四\4点交联法:使酶与具有两个以上官能团的试剂(戊二醛)进行反应,应用化学键把酶固定。
包埋法:将酶包在凝胶微小格子内,或是将酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、胶原、卡拉胶等。包埋法简单,可适用于大多数酶。当前第5页\共有24页\编于星期四\4点当前第6页\共有24页\编于星期四\4点当前第7页\共有24页\编于星期四\4点二、固定化酶和细胞的性质
1、固定化后的活性
酶经固定化后,活力降低。原因是:a.
酶和载体结合时,活性中心的氨基酸也或多或少地参与了结合,使得酶的结构发生部分变化,酶活力有一部分丧失。b.
由于载体的存在,有空间位阻,影响底物和酶接触,酶的活性得不到全部表达。细胞固定化后,一般酶活力不下降。细胞内酶受细胞膜、壁的保护。8.1
固定化方法及固定化后酶和细胞的的性质当前第8页\共有24页\编于星期四\4点固定化酶结构的改变当前第9页\共有24页\编于星期四\4点2、稳定性酶或细胞被固定化后,由于载体的存在,酶分子的结构或细胞被约束,对外部恶劣环境的敏感性下降,使其稳定性增加(对热、对各种化学试剂等)。而且有时稳定性增加的幅度比较大。当前第10页\共有24页\编于星期四\4点3、催化活性(底物专一性,反应的pH值,T,动力学常数)a.
底物专一性:当底物为大分子时,酶或细胞对底物专一性下降;当底物为小分子时,酶或细胞对底物专一性变化不大。b.最适pH:依固定化载体与酶分子、细胞上所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化,有的不变化,有的向pH小的方向移动,有的向pH大的方向移动。当前第11页\共有24页\编于星期四\4点3、催化活性(底物专一性,反应的pH值,T,动力学常数)c.反应的最适温度固定化酶、细胞的最适温度往往升高,升高的幅度不同,2~15
oC不等。d.动力学常数酶:米氏常数km反映了酶和底物的亲和力。固定化酶的表现Km(app)与游离酶的Km相比有些不变,有的变化很大。当前第12页\共有24页\编于星期四\4点3、催化活性(底物专一性,反应的pH值,T,动力学常数)原因可能是:载体间的静电作用,以及扩散效应。如果固定化酶区域的底物浓度比外部液相主体溶液高,Km(app)下降。相反,用包埋法的固定化酶的Km(app)值,可较游离酶多两个数量级。这是由于凝胶中的扩散效应使底物浓度减少,导致内部底物浓度低于外部区域的浓度,Km(app)上升。对于固定化细胞,情况类似。Vmax一般不变化。当前第13页\共有24页\编于星期四\4点当前第14页\共有24页\编于星期四\4点8.2固定化酶和固定化细胞的应用
在70年代初,首先固定单一的酶,催化单一反应;随后同时固定两种酶或两种以上的酶,以及固定化酶和辅酶,催化复杂一些的反应;再后来发展起来的固定化细胞技术,使得不易提取的不稳定的酶的利用有了方便条件,还可以利用活细胞的完整代谢体系来完成复杂的反应。如乙醇的生产。当前第15页\共有24页\编于星期四\4点8.2固定化酶和固定化细胞的应用在固定化酶、固定化细胞的研究中发展起来的亲和层析技术,已经远远超出了利用酶和微生物进行催化反应的范畴。例如抗体抗原的提纯是利用了特异的免疫吸附反应。当前第16页\共有24页\编于星期四\4点固定化酶和细胞技术的显著特点:1.连续反应;2.获得的产物纯度高;3.固定化酶或细胞可重复使用,减少了浪费;4.易实现自控。当前第17页\共有24页\编于星期四\4点应用实例:DL-氨基酸的光学拆分人体只能利用L-氨基酸,所以L-氨基酸在食品医药领域的应用非常广泛,并且需要量不断增加。化学合成法是生产氨基酸的方法之一,该法成本低,但生产出来的氨基酸是DL外消旋体。要想把L-氨基酸分离出来,需要进行光学拆分。
当前第18页\共有24页\编于星期四\4点复习几个概念:外消旋体:对映体的右旋体和左旋体等量混合后,它们的旋光性相互抵消,不再有旋光性。这样的混合物称为外消旋体,以D、L表示。外消旋体可以用适当方法拆开或分开。当前第19页\共有24页\编于星期四\4点复习几个概念:外消旋化:在一般情况下,和不对称碳原子相连的四个原子或原子团,不能随意调换位置,因此对映体不能相互转换,旋光度维持不变。
但在热、光、或者化学试剂的影响下,不对称碳原子上的原子或原子团可发生调换现象,使旋光物质转化为它的对映体,最后得到外消旋体,原来100%的左旋体,经变化后,变成50%左旋体和50%的右旋体,这种现象称为外消旋化。当前第20页\共有24页\编于星期四\4点DL-氨基酸光学拆分中,以酶法最佳,它是利用酰化氨基酸水解酶,制备纯度高的L-aa,且收率高。
氨基酰化EDL-R-CHCOOH+H2OL-R-CH-COOH+D-R-CHCOOH
不对称水解
NH2NH2NHCOŔ
溶解度小酰化-DL-aaL-aa酰化D-aa
外消旋化外消旋体当前第21页\共有24页\编于星期四\4点固定化酶光学拆分DL-氨基酸生产流程当前第22页\共有24页\编于星期四\4点1969年,日本千钿一郎成功地利用固定化酰化氨基酸水解酶,由酰化-DL-氨基酸连续生产L-aa获得成功。这是世界上固定化酶在工业生产上应用的第一个实例。各种光学活性氨基酸都用这种方法生产。该项技术成功的关键是制造出适合于工业化要求的固定化酶。当前第23页\共有24页\编于星期四\4点果葡糖浆的生产
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