基因组学功能基因组学蛋白质组学

人类基因组计划的启动

1986年诺贝尔奖获得者R.Dulbecco（杜尔贝科）提出人类基因组计划——测出人类全套基因组的DNA碱基序列（3X109bp）当前第1页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2711975年，获诺贝尔生理医学奖 当前第2页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/272

美国政府决定于1990年正式启动HGP，预计用15年时间，投入30亿美元，完成HGP。

由国立卫生研究院和能源部共同组成“人类基因组研究所”

逐渐地，HGP扩展为多国协作计划。参与者包括：英、日、法、德和中国（1993年）当前第3页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/273DNA测序技术飞速提高

1998.5.9J.C.Venter等宣布，组建商

业公司，投入3亿美元，3年内完成。接着又有若干家公司成立，

总共投入资金约几十亿美元，形成

“公”“私”并进格局当前第4页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/274当前第5页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/275二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成当前第6页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/276人类基因组草图基本信息由31.65亿bp组成含3~3.5万基因与蛋白质合成有关的基因占2%人类基因组人类蛋白质61%与果蝇同源43%与线虫同源46%与酵母同源当前第7页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/277基因组学（genomics）：是阐明整个基因的结构、结构与功能的关系以及基因之间相互作用的科学。功能基因组学（functionalgenomics）：是研究所有基因的功能的科学。蛋白质组学（Proteomics）：是在整体水平上研究细胞内蛋白质及其活动规律的科学。当前第8页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/278当前第9页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/279第一节基因组学基因组（genome）：是细胞或生物体中一套完整的遗传物质（真核生物包括核基因组及线粒体基因组两部分）。基因（gene）：是基因组中一个功能性遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。当前第10页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2710遗传图谱转录图谱0.7cM或kb

序列图谱物理图谱100kbSTSmap四张图：物理图、转录图遗传图、序列图

四、HGP的主要任务当前第11页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2711基因组（genome）一词是由HWinkler于1920年提出来的，表示一个生物种配子中染色体的总和。现在基因组一词更常指细胞或生物体的全套遗传物质。基因组学（genomics）是由美国人Roderick在1986年提出并与《Genomics》一起问世。当前第12页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2712人类基因组计划的科学意义确定人类基因组所携带的全部遗传信息，认识自我，从而揭开人类生长发育的奥秘，追求健康，战胜疾病。主要基因组计划的基本情况：到目前为止，已经完成了酵母、线虫、果蝇、拟南芥、人类和水稻等真核生物基因组及数十个原核生物基因组。当前第13页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2713当前第14页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2714一、人类基因组计划的主要研究内容（一）遗传图谱（geneticmap）：利用人类基因组中的一些特殊位点作为遗传标志而进行的基因组分区。又称连锁图谱(linkagemap)，它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。当前第15页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2715遗传图采用遗传学距离(geneticdistance)作为图距，单位cM。cM值越大，两者之间距离越远。人类基因组的遗传大小已经确定为3600cM。通过遗传图分析，可以了解各个基因或DNA片段之间的相对距离。遗传标志：1、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)2、短串联重复序列(STR)3、单核苷酸多态性(SNP)当前第16页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27161、形态学标记形态学标记(morphologicalmarker)

能够用肉眼识别和观察、明确显示遗传多样性的外观性状。特点

简单直观，但标记数目少，多态性低，易受外界条件的影响；依据它进行选择的准确性差，所需时间较长，选择效率也较低。当前第17页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27172、细胞遗传标记细胞遗传标记(cytologicalgeneticmarker)主要是指染色体核型（染色体数目、大小、随体、着丝粒位置、核仁组织区等）、带型（Q、G、C、R带型）和数量特征的变异等，它们分别反映了染色体在结构上和数量上的遗传多态性。当前第18页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2718家猪X、Y染色体G带示意图当前第19页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2719细胞遗传标记的特点不受环境影响，呈孟德尔方式遗传。多态性集中表现在染色体高度重复DNA结构的异染色质所在的部位。细胞遗传标记经常伴有对生物有害的表型效应，难以获得相应的标记材料，或者观测和鉴定比较困难，从而限制了细胞遗传标记的应用。当前第20页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27203、生化与免疫遗传标记免疫遗传学标记(immunogeneticalmarker)以动物的免疫学特性为标记，包括红细胞抗原多态性和白细胞抗原多态性。生化遗传标记(biochemicalgeneticmarker)主要是指在同一动物个体中具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体。当前第21页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2721同工酶与等位酶同工酶(isozyme)：电泳所可区分的同一种酶（系统）的不同变化等位酶(allozyme)：由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同当前第22页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2722等位酶分析的过程材料的采集研磨和酶的提取酶的保存淀粉凝胶制备电泳凝胶切片酶的组织化学染色酶谱的记录与分析数据分析当前第23页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2723生化与免疫遗传标记的特点与形态学标识和细胞遗传标记相比，数量更丰富，受环境影响更小，检测手段简便，是一种较好的遗传标记。血液型和细胞质型都是基因表达的产物，局限于反映基因组编码区的遗传信息，且标记的数量还比较有限，不能很好地覆盖整个基因组。当前第24页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27244、分子遗传标记分子遗传标记(moleculargeneticmarker)是一种新的以DNA多态性为基础的遗传标记.随着分子生物学的发展，相继建立了RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多种分子遗传标记检测技术，开创了遗传标记研究的新阶段。当前第25页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2725分子遗传标记的特点无表型效应不受环境的限制和影响普遍存在于所有生物数量丰富等特殊优势当前第26页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27265、理想的分子遗传标记应具备的特点遗传多态性高;检测手段简单快捷，易于实现自动化;遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基因的3种基因型。标记遍布整个基因组；准确性，能正确反映动物的真实遗传，即标记是经济性状基因，还是与影响重要性的性状连锁。实验重复性好（便于数据交换）；开发成本和使用成本尽量低廉；

当前第27页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2727二、分子遗传标记1、RFLP：限制性片段长度多态性2、TRS：串联重复序列标记3、SNP：单核苷酸多态性当前第28页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27281、限制性片段长度多态性RFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism最早应用于动植物遗传学研究的分子标记技术当前第29页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2729RFLP的原理利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小不等、数量不同的分子片段，经电泳分离，通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜(尼龙膜或硝酸纤维素膜)上，然后用放射性同位素(32P)或非同位素(如地高辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片段进行杂交。不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得RFLP谱带表现出不同程度的多态性.当前第30页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2730限制性酶切长度多态性(RFLP)当前第31页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2731限制性内切酶的酶切原理：当前第32页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2732DNA分子上多态性位点在等位基因中存在与否是不同的。当前第33页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2733RFLP的特征RFLP是第一种被用于作图研究的DNA标记，它们一般有如下特征：1）处于染色体上的位置相对固定；2）同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变；3）同一凝胶电泳可显示不同多态性片段，具有共显性特点。当前第34页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2734PCR－RFLP将PCR技术用于RFLP分析，即PCR-RFLP。该技术先用1对引物特异性扩增基因组的某一高变区，然后用限制性内切酶消化PCR产物，电泳检测多态性。PCR-RFLP分析省去了探针的制备、分子杂交等繁琐的过程，DNA需求量也少，大大简化了传统的RFLP技术。当前第35页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2735PCR－RFLP的应用••••••CCTGAGGAG••••••••••••CCTGTGGAG••••••••••••CCTGAGGAG••••••••••••CCTGAGGAG••••••••••••CCTGTGGAG••••••••••••CCTGTGGAG••••••√MstⅡ酶切位点×MstⅡ酶切位点消失PCR-RFLPProValGluProGluGlu123正常杂合异常当前第36页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2736检测不同个体RFLP的技术

Southern印迹杂交（Southernblothybridization）

多聚酶链式反应或PCR（Polymerasechainreaction）当前第37页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2737Southernblot当前第38页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2738PCR（Polymerasechainreaction）

当前第39页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2739当前第40页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2740当前第41页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2741短串联重复序列(STR)当前第42页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2742小卫星序列（minisatellite），有时又称可变串连重复（variablenumberoftandemrepeats,VNTR­），其重复单位的长度为数十个核苷酸。微卫星序列（microsatellite）或简单串联重复（simpletandemrepeats,STRorSSR），其重复单位为1-6个核苷酸，由10-50个重复单位串联组成。有二种类型的SSLP常用于作图当前第43页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2743DNA指纹图谱原理①选择在VNTR特异序列上没有酶切位点的限制性内切酶将动物总基因组DNA切成不同长度的片段②以VNTR中特异序列作为探针，进行Southern杂交，③由于不同个体的串联重复序列的数目和位置不同，形成的杂交谱带具有个体的特异性，人们称为DNA指纹图谱(DNAfingerprinting,DFP)当前第44页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2744VNTR示意图123A

B

C123VNTR变异的原理示意图当前第45页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2745当前第46页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2746DFP的特点多态性检测率高，位点呈共显性遗传个体具有高度特异性技术复杂、成本高，有时谱带过于复杂当前第47页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2747⑵微卫星（microsatelliteDNA,MS)又称简单序列重复(simplesequencerepeat,SSR)是高度重复序列，广泛存在于真核生物基因组，重复单位的核心序列为2~6bp。当前第48页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2748微卫星遗传标记的原理以微卫星DNA标记两侧特异性序列设计专一引物，通过PCR技术扩增微卫星片段，扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，不同个体间因核心序列的重复次数不同而产生DNA多态性。当前第49页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2749微卫星遗传标记示意图ABPCR扩增凝胶电泳123

AAAB

BB当前第50页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2750SNP标记的特点⑴高密度

SNP是基因组中最普遍、频率最高的遗传标记。单个SNP虽然只有两个等位基因，多态信息含量不如微卫星位点，但其高密度弥补了其不足。当前第51页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2751单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）

当前第52页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2752SNP标记的特点⑴高密度

SNP是基因组中最普遍、频率最高的遗传标记。单个SNP虽然只有两个等位基因，多态信息含量不如微卫星位点，但其高密度弥补了其不足。当前第53页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2753⑵代表性

某些位于基因表达序列内的SNP(codingSNP,cSNP)，有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，鉴别cSNP对于复杂表型性状与基因变异之间的关联分析具有重要意义。当前第54页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2754⑶易实现自动化分析

双等位标记，检测时只需“有或无”表示。DNA芯片技术实验了SNP分析的高通量、微型化和自动化。当前第55页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2755检测SNP的特异杂交

当前第56页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2756DNA芯片（DNAchip）技术

当前第57页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2757DNA芯片

当前第58页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2758动态等位专一性杂交（Dynamicallele-specifichybridization,DASH）

反应在溶液中进行，样品置于96孔板的每个凹槽中，由于荧光标记试剂只与双链DNA结合，所以只有可杂交的分子发出荧光。实验初始时保持可使单个碱基错配的反应条件，此时寡聚核苷酸可与任何等位SNP分子杂交。随后逐步提高反应温度，由于完全互补配对的杂交分子较之含有错配硷基的杂交分子可耐受较高的温度，因此当反应温度升高到临界点时，含有错配的杂交分子将会解链，荧光信号同时消失，说明该样品中含有SNP当前第59页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2759“遗传图”的建立为人类疾病相关基因的分离克隆奠定了基础。拥有5000多个遗传学位点，相当于把整个人类基因组划分为5000多个小区，并分别设置了“标牌”。这些标牌将在搜索功能基因的过程中发挥独特的作用。当前第60页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2760把多态性的疾病基因位点（该位点至少包括“正常”及“致病”两个等位基因）与上述遗传标记进行分析比较时，如果在家系中证实该基因与某个标记不连锁（重组率为50%），表明该基因不在这一标记附近。当前第61页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2761如果发现该基因与某个标记有一定程度的“连锁”（重组率小于50%但大于0），表明它可能位于这个标记附近；如果该基因与某标记间不发生重组（重组率等于0），我们就推测该标记与所研究的疾病基因可能非常接近。当前第62页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2762其它的DNA标记（分子标记）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism

即扩增片段的长度多态性）STS（序列位点标签）是由一段长度为２００～５００ｂｐ的序列所界定的位点，在基因组中只出现一次RAPD（RandomAmplfiedPolymorphicDNA随机扩增多态性ＤＮＡ）当前第63页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2763遗传作图的方法孟德尔遗传学简介当前第64页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2764连锁分析当前第65页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2765人类系谱分析的例子当前第66页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2766酵母3号染色体遗传图与物理图比较当前第67页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2767（二）物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段(序列标签位点，sequence-taggedsite,STS)为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。当前第68页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2768物理作图常用的方法1、荧光原位杂交图

2、限制性酶切图3、辐射杂交细胞图4、连续克隆系图当前第69页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2769用不同颜色标记的各种DNA序列（探针），与染色体上的互补序列杂交而不破坏染色体的整体形态，显微镜下观察、辨认荧光标记在染色体上的定位而绘制的图谱。1、荧光原位杂交图（FISHMap）当前第70页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2770当前第71页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2771当前第72页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2772当前第73页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2773当前第74页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2774当前第75页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2775当前第76页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2776

2、限制性酶切图：选用合适的限制性内切酶对基因组DNA或部分基因组DNA进行酶切，以获得以酶切位点为标记的物理图。

当前第77页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2777当前第78页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2778DNA分子限制性作图获得理想大小的DNA片段对基因组的限制性作图至关重要，其关键是选择合适的限制酶识别位点硷基数目

预计DNA片段平均长度（kb）

4

0.2546

48

6410

1000当前第79页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2779限制性酶切制图的局限性1、限制位点多时，产生大量的片段，难以排序

2、无法区分大小相同的片段当前第80页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2780稀有切点限制图绘制稀有切点限制酶系指该酶识别的碱基顺序在基因组中只有很少数量，可产生较大的DNA片段。选用稀有切点限制酶时有几点必须注意：1）一般而言，识别顺序越长产生的片段越大。但是，当识别位点中含有非特异顺序时，由于随机选择的干扰，片段的长度比预期的小。2）识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。3）有些限制酶识别位点较长，4）基因组DNA的甲基化状态。当前第81页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27813、辐射杂交细胞图：利用X－射线照射人细胞，使染色体随机断裂，然后与啮齿动物细胞杂交克隆，人染色体片段被整合到啮齿动物染色体上。两个相邻基因或标记越近，越可能出现在同一个片段而进入同一个杂交细胞。通过识别、定位技术及统计学分析可计算人DNA标志的连锁关系。当前第82页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2782当前第83页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2783连续克隆系图：是最重要的一种图谱，以序列标签为标志。序列标签：STS是基因组中任何单拷贝的长度在100～500bp之间的DNA序列，与核酸内切酶识别序列相关联。序列标签的特点：1、长度为100～500bp的已知序列；2、在染色体上的位置明确；3、可用PCR方法进行扩增的单一拷贝。当前第84页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2784大片段DNA的分离回收脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)

基本原理：将一个方向不断变换的电场取代简单的单一电场（单向电场），使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，达到分离的目的。当前第85页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2785常规或非常规琼脂糖凝胶电泳

当前第86页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2786收集用于STS作图的DNA片段

当前第87页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2787两个STS标签在基因组上靠得近，它们就会一直同时出现在DNA大片段上；两个STS标签在基因组上相距较远，它们同时出现在一个DNA大片段上的几率就会小得多。关键：得到5套以上包含相关染色体或整个基因组的DNA片段是建立STS物理图的先决条件。然后，可以通过拼接而得STS物理图。当前第88页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2788将带有STS的基因组或部分基因组DNA，随机断为一定大小的片段后克隆，用探针杂交检测重建片段的位置。当前第89页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2789四种指纹分析方法

当前第90页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2790大片段克隆载体酵母人工染色体（yeastartificialchromosomes,YAC）酵母人工染色体载体pYAC3物理图当前第91页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2791外源DNA的克隆过程当前第92页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2792细菌人工染色体当前第93页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2793P1人工染色体当前第94页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2794序列图谱以某一染色体DNA上所含的全部碱基序列绘制图谱，包括：转录序列非转录序列是转录序列、非转录序列、调节序列及功能未知序列的总和。当前第95页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2795DNA序列测定的意义DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。当前第96页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2796DNA序列测定技术的发展当前第97页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2797DNA测序的技术关键DNA分离纯化技术的发展DNA合成的随机终止或DNA的随机断裂电泳技术的发展和完善工具酶的发现探针及探针标记当前第98页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2798DNA序列测定的方法Sanger的加减法Sanger的双脱氧末端终止法Gilbert－Maxam的化学修饰法DNA序列的自动分析基因芯片技术(杂交测序)PCR测序当前第99页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/2799DNA序列测定加减法简介1、加法测序：将测序DNA样品分类四分，形成四个反应体系。分别称为加A、加C、加G和加T。即在反应体系中加入dNTP时，加A体系中其它三种底物量相同，而dATP为过量。以被测DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下进行DNA的合成。因酶与模板的结合及合成过程为随机的而A为过量，因此合成反应终止在A。当前第100页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27100ACGTTACGTTGCACGTTCCACTGTGCAATGCAACGTGCAAGGTGATGCAATGCAACGTGCAATGCAATGCAACGTGCATGCAATGCAATGCAATGCATGCAATGCA加A体系当前第101页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27101ACGTTACGTTGCACGTTCCACTGTGCAATGCAACGTGCAAGGTGTGCAATGCAACGTGCAAGGTGCAATGCAACGTGCAAGTGCAATGCAACGTGTGCAATGCAACGTGCAATGTG加G体系当前第102页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27102TGCAATGCAACGTGCAAGGTGACACGTTACGTTGCACGTTCCACTGTGCAATGCAACGTGCTGCAATGCAACTGCAATGCTGC加C体系当前第103页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27103ACGTTACGTTGCACGTTCCACTGTGCAATGCAACGTGCAAGGTTGCAATGCAACGTTGCAAT加T体系加AIIIIIII加GIIIIIII

加CIIIII加TIII

cagtggaacgtgcaacgtaacg当前第104页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27104DNA序列测定双脱氧合成终止法原理：是在加减法的基础上发展起来的新的测序方法，也是目前手工测序的主要方法。被测DNA分为四分，也称作加A、加C、加G和加T体系，以被测DNA为模板，由DNA聚合酶合成新的DNA分子。在四个反应体系中四种底物量相同，但额外增加ddNTP中的一种，反应时，酶选择底物是随机的，因此反应为随机终止。当前第105页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27105当前第106页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27106OH当前第107页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27107当前第108页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27108DNA序列测定模板：即被测DNA。有两种DNA可以做为测序模板：纯单链DNA或变性DNA双链DNA当前第109页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27109DNA序列测定引物：与模板完全互补的15～29个核苷酸片段。DNA聚合酶：测序反应中的常用DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I大片段测序酶：是一种经过化学修饰的T4噬菌体DNA聚合酶，完全失去了3’→5’外切活性。TaqDNA聚合酶：用于PCR循环测序当前第110页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27110当前第111页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27111DNA序列测定Maxam－Gilbert化学降解法测序原理：利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。当前第112页\共有125页\编于星期三\2点2023/5/27112DNA序列测定选择性试剂嘧啶选择性试剂：肼(H2NNH2)，在碱性条件下，能作用于T/C，使DNA在该处产生无嘧啶而使磷酸二酯键不稳定发生断裂。在有盐存在下，肼对T的选择下降，此时肼主要对C发生消除反应产生无嘧啶结构，使磷酸二酯键断裂。因此在肼的作用下，使DNA在T或C处断