基因工程的工具及操作程序

（优选）基因工程的工具及操作程序当前第1页\共有69页\编于星期三\2点基因工程当前第2页\共有69页\编于星期三\2点基因工程当前第3页\共有69页\编于星期三\2点基因工程当前第4页\共有69页\编于星期三\2点补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。当前第5页\共有69页\编于星期三\2点①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子当前第6页\共有69页\编于星期三\2点补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子

外显子

能够编码蛋白质的序列叫做外显子

不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：当前第7页\共有69页\编于星期三\2点原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码当前第8页\共有69页\编于星期三\2点什么叫基因工程？基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。（一）基因工程的概念当前第9页\共有69页\编于星期三\2点基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因（DNA）分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组当前第10页\共有69页\编于星期三\2点基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？当前第11页\共有69页\编于星期三\2点基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞当前第12页\共有69页\编于星期三\2点解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：基因的剪刀——限制性内切酶基因的针线——DNA连接酶基因的运载工具——运载体当前第13页\共有69页\编于星期三\2点1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。（原核细胞内的限制修饰系统）特点：特异性。即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。（二）DNA重组技术的基本工具当前第14页\共有69页\编于星期三\2点当前第15页\共有69页\编于星期三\2点大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶当前第16页\共有69页\编于星期三\2点限制酶当前第17页\共有69页\编于星期三\2点什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。当前第18页\共有69页\编于星期三\2点当前第19页\共有69页\编于星期三\2点要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。当前第20页\共有69页\编于星期三\2点2.DNA连接酶——“分子缝合针”

DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。当前第21页\共有69页\编于星期三\2点当前第22页\共有69页\编于星期三\2点外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？导入过程需要运输工具——运载体。运载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。当前第23页\共有69页\编于星期三\2点作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去;当前第24页\共有69页\编于星期三\2点3.基因进入受体细胞的运载——”分子运输车”常用的运载体主要有两类：1）细菌细胞质的质粒2）噬菌体或某些动植物病毒当前第25页\共有69页\编于星期三\2点质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。

质粒是基因工程最常用的运载体。绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。当前第26页\共有69页\编于星期三\2点大肠杆菌的质粒：

最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。当前第27页\共有69页\编于星期三\2点基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞（并筛选）4、目的基因的检测与鉴定当前第28页\共有69页\编于星期三\2点当前第29页\共有69页\编于星期三\2点一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）鸟枪法（2）反转录法（3）化学合成法当前第30页\共有69页\编于星期三\2点(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库

基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库当前第31页\共有69页\编于星期三\2点基因组文库与部分基因文库的关系怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?当前第32页\共有69页\编于星期三\2点2.基因文库的构建方法①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)(一)从基因文库中获取目的基因当前第33页\共有69页\编于星期三\2点②反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶H2.基因文库的构建方法DNA聚合酶双链DNA(目的基因)当前第34页\共有69页\编于星期三\2点③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成2.基因文库的构建方法当前第35页\共有69页\编于星期三\2点上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因当前第36页\共有69页\编于星期三\2点(二)利用PCR技术扩增目的基因当前第37页\共有69页\编于星期三\2点①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________(做启动子)、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因当前第38页\共有69页\编于星期三\2点⑥过程：a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链当前第39页\共有69页\编于星期三\2点当前第40页\共有69页\编于星期三\2点1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。(二)基因表达载体的构建——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同当前第41页\共有69页\编于星期三\2点质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）——核心同一种(二)基因表达载体的构建4.过程:当前第42页\共有69页\编于星期三\2点5.基因表达载体的组成：复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因它们有什么作用？当前第43页\共有69页\编于星期三\2点(三)将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞法将含有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，进入受体细胞的过程。受体细胞的选择？当前第44页\共有69页\编于星期三\2点1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围(三)将目的基因导入受体细胞当前第45页\共有69页\编于星期三\2点2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：(三)将目的基因导入受体细胞当前第46页\共有69页\编于星期三\2点将目的基因导入动物细胞当前第47页\共有69页\编于星期三\2点(三)将目的基因导入受体细胞3、将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？（2）方法：当前第48页\共有69页\编于星期三\2点3.将目的基因导入微生物细胞

大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.第三步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。当前第49页\共有69页\编于星期三\2点1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。当前第50页\共有69页\编于星期三\2点(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交（DNA--DNA）分子杂交（mRNA--cDNA）（注意与上不同之处）抗原--抗体杂交当前第51页\共有69页\编于星期三\2点DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。当前第52页\共有69页\编于星期三\2点基因探针：是一段带有放射性同位素或荧光标记，含有目的基因的DNA单链。使探针与转基因生物的基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。当前第53页\共有69页\编于星期三\2点1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”一，基因工程的基本工具2.NDA连接酶——“分子缝合针”3.运载体——“分子运输车”知识梳理：当前第54页\共有69页\编于星期三\2点二，基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞（并筛选）4、目的基因的检测与鉴定当前第55页\共有69页\编于星期三\2点（一）目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）鸟枪法（2）反转录法（3）化学合成法当前第56页\共有69页\编于星期三\2点上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因当前第57页\共有69页\编于星期三\2点1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。(二)基因表达载体的构建——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同当前第58页\共有69页\编于星期三\2点质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）——核心同一种(二)基因表达载体的构建4.过程:当前第59页\共有69页\编于星期三\2点基因表达载体的组成：复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因它们有什么作用？当前第60页\共有69页\编于星期三\2点(三)将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞法将含有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，进入受体细胞的过程。受体细胞的选择？筛选——利用选择培养基进行筛选（标记基因）当前第61页\共有69页\编于星期三\2点(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交（DNA--DNA）分子杂交（RNA--cDNA）（注意与上不同之处）抗原--抗体杂交当前第62页\共有69页\编于星期三\2点基因工程的理论基础：思考？所有生物的DNA都由相同的四种脱氧核苷酸组成所有的生物共用一套遗传密码