基因工程原理与技术复习题

《基因工程原理与技术》复习题第一章绪论一、名词解释因或基因组进行改造，使物种获得新的生物性状，并且能够稳定遗传的一种技术。器官功能或精神特性、和行为方式等的统称。RNA列信息以及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。·基因表达：基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子或功能性RNA的过程。二、简答题什么是基因工程技术？请简要描述基因工程技术的基本操作步骤。答：基因工程技术是指以分子生物学、分子遗传学和生物化学等学科为基础，在分子水平对基因或基因组进行改造，使物种获得新的生物性状，并且能够稳定遗传的一种技术。广义的基因工程技术是指重组DNA大组成部分，狭义的基因工程是指上游技术。基因工程技术基本操作步骤：①分离目的基因②将载体与目的基因进行限制性酶切③将外源基因与载体连接起来④重组后的载体转化受体菌⑤转化后对重组子的筛选⑥使外源基因在宿主体内稳定遗传表达请分别描述原核生物和真核生物基因的结构特征。答：原核生物基因：基因组较小，具有操纵子结构，基因密度高，结构基因中无内含子结构，多为单拷贝，遗传物质载体内部不形成细胞核结构，基因转录产物为多顺反子。真核生物基因：DNA与蛋白质相结合形成染色体储存在细胞核中，基因转录产物为单顺反子，存在大量的重复序列，基因并不连续，存在内含子结构三、论述题1、什么是基因工程技术？试从理论和技术两个方面谈谈基因工程诞生的基础，并结合基因工程在生物技术中的地位，谈谈基因工程在生物产业中的重要性及发展前景？：基因工程技术是指以分子生物学、分子遗传学和生物化学等学科为基础，在分子水平对基因或基因组进行改造，使物种获得新的生物性状，并且能够稳定遗传的一种技术。广义的基因工程技术是指重组DNA为遗传物质②DNA双螺旋结构发现③中心法则这三大理论的出现，以及生物化学，分子生物学，分子遗传学的研究；技术上基于：①工具酶的发现和应用②基因的合成与测序技术③载体的发现及应用等上述技术的产生。由上述这些理论和技术基础使得基因工程技术诞生。基因工程技术在生物技术中占有首要地位，它能够实现是宿主生物具有全新的性状，或调节某性状的水平因此具有极其广阔的应用前景，它可以用于医药领域进行工程菌株设计以实现药物生产；在研究上，可以用于实验研究，使得对基因的研究更加深入；农业上改造作物获得抗虫害等性状等。基因工程技术在农业，医药，生物研究等领域都有着重要用途，同时也有着无比广阔的前景。第二章基因工程技术的应用一、论述题1．展前景的应用领域或你最感兴趣的应用领域（说明理由）。答：①基因工程用于食品领域，例如改良面包酵母十七麦芽糖透性酶及麦芽糖酶的含量更高，生产面包口感更好。此外还有啤酒，酱油等的基因改造菌株，或是改造动物获得更高的蛋白含量等。②化工领域，例如改造微生物生产蛋白酶等，用于洗涤剂的生产。③医药领域，例如通过基因工程技术改造大肠杆菌使其生产人胰岛素，进行工业化生产，大大降低了胰岛素的生产成本。此外还有利用基因工程改造微生物生产干扰素，白介素等药物④农业领域，例如：利用转基因的微生物改善植物的营养情况，作为微生物肥料，或者改造植物使其具有抗虫害等特性，有利于农业生产。以及其他利用该技术生产微生物农药，转基因微生物饲料等⑤能源领域，例如基因改造具有分解木质纤维素为乙醇的菌种，使其能够大规模用于工业化。⑥环境领域，例如基因工程改造菌株使其具有分解多种烃类物质的能力，可以用于解决石油泄漏造成的污染。我认为最有发展前景的应用领域为基因工程改造微生物用于医药领域。对于许多产物细胞是一个天然的反应器，可以通过基因工程技术改造使得细胞的某些产物产量大量上升，降低成本，由此可以大规模生产我们所需的某些物质。由于世界老龄化程度上升我认为人们对于医药方面的需求会愈来愈大，那么基因改造菌株生产药物的需求将会更大。第三章基因工程的重要技术一、名词解释PCR技术：指模仿细胞内DNADNA，4（dNTP）DNA巢式PCR：也称为套式引物PCR，PCRPCRPCR扩增。不对称PCR：用不等量的一对引物对目标DNA序列进行扩增的一种技术，这对引物分别是特异性引物和非特异性引物，扩增后产生大量的单链DNA。PCR：设计多循环反应的程序，开始时的退火温度选择为高于Tm（扩增特异性），Tm（合适的退火温度）PCRPCR：mRNAoligo(dT)cDNAcDNA，PCR实时荧光定量PCR：指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积对整个PCR进程实现实时监测，从而对起始模板进行定量分析的方法。RACEPCR：二、简答题CTAB法提取基因组DNA的原理、基本步骤及注意事项。CTABCTABCTAB-DNACTABCTAB溶剂进行抽提去除蛋白，多糖，酚类等杂质，取上层溶液加入酒精进行沉CTAB-DNADNADNACTAB15℃时形成沉淀析出，因此在将其加入15℃DNA提取。SDS法提取基因组DNA的原理、基本步骤及注意事项。答：SDSDNASDSSDSNHAc)浓度并降低温度（冰浴），4DNA/氯仿抽提，反复抽提后用DNA，DNADNASDS简要描述碱裂解法提取质粒DNA的基本原理和操作步骤。pH12.5DNADNApH4.6KAcpHDNADNADNARNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。ph=12.5DNA，蛋白质等ph=4.6KAcphDNARNA，蛋白质等沉淀除去，取上清液用有机溶剂进行抽提质粒DNA，之后再加入乙醇进行离心，取沉淀进行洗涤干燥，之后重新溶解形成质粒DNA溶液。简述异硫氰酸胍法提取总RNARNase的降解？答：①基本原理：异硫氰酸胍为强烈的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，使总RNA从细胞中释放出来；同时其为还原剂可以使内源性RNase变性失活,防止RNA被降解。TRIzol用氯仿变性沉淀蛋白质，离心处理取上清液，加入异丙醇再次离心，RNARNAddH2ORNA，RNA，-20保存。RNARNAβ-RNADEPCRNA核酸物质提取后，怎样分析其纯度和浓度？怎样判断所提取核酸的完整性（是否发生降解及降解程度）？答：①可以通过紫外分光光度计对于所提取的核酸物质分析其纯度，检测OD260/OD280OD260/OD230DNA,OD260/OD280=1.8,OD260/OD230>2,RNA，OD260/OD280=1.7-2,若大于则说明有异硫OD260/OD230>2于则说明有残留的盐及小分子物质。可以使用紫外分光光度计法测定提取核酸DNA，OD260=150ng/μl；RNAOD260=1时，浓度为40ng/μl，由此可以计算浓度=OD260*稀释倍数*50/1000(RNA则*40/1000).RNA18SRNA（16sRNA23sRNA），若28sRNA：18sRNA≈2：1，则说明表面总RNA完整性较好。简要描述从真核生物总RNA中分离纯化mRNA的原理和方法。oligo(dT)mRNARNApolyATmRNARNAmRNAmRNARNA-oligo（dT）与mRNApolyAmRNAmRNAmRNA。PCRPCR引物的合理设计，使扩增产物片段的两端含有相应的限制性酶切位点序列？答：①PCRDNADNADNA4（dNTP）DNA②引物设计的原则：a，PCR18-30b，随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶的堆积现象；c，G+C左右；d，引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构；e，两个引物之间不应存在互补序列；f，特异性扩增；g，3′DNA3′端必须具有游离的-OH；h，5′端可以修饰。5’端加上所要进行酶切的酶切位点，PCR使扩增产物两侧含有相应的酶切位点。PCR/择的依据分别是什么？DNADNA/TmDNAPCR以解决？dNTPs低非特异性扩增④适当升高退火温度，使扩增更加特异性。PCR点。答：①SYBRGreen：SYBRGreenDNA变性时，DNADNADNADNA，不必设计复杂的探针，非常灵敏和便宜；缺点是容易与DNA同时其对引物的特异性要求较高。②TaqmanTaqman5’基团，3‘光被淬灭基团所淬灭，而当探针不完整时则会发出荧光。该探针与目标序列特PCRTaqDNA5’3’的外切酶活性，会切割探针从而使探针发出荧光，通过检测荧光信号，则可以得到扩增产物的量。优点是，具有对目标序列的高特异性，阴性结果确定，引物设计相对简单，重复性良好；缺点是只适合一个特定的目标，且价格高昂。PCRPCR答：①原理及步骤：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应。第二对引物（内引物）位于第一对引物（外引物）PCRPCRPCRPCR。由于其两套引物的设计可以扩增出低丰度的基因，1213目标片段获取提供了方法。三、论述题1.DNA复制对生命遗传至关重要，而PCR技术是体外扩增DNA的重要手段。阐述体内DNA复制和体外PCR扩增DNA的异同点。DNADNA5’3’DNA②不同之处：首先复制过程存在差异。体内复制时形成一个复制叉，在一条DNA5‘3’DNADNADNADNADNA5’3’3’5’DNA够识别错配并修正，体外并没有这样的功能。再次体内的复制所进行的温度为体温，体外扩增的温度远高于体内的温度。第四章目的基因的分离与修饰一、名词解释基因文库：指贮存了某种生物全部基因信息的一个受体菌群体，基因信息可以是基因组DNA序列，也可以是由mRNA逆转录的cDNA。基因组文库：某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中，这个群体就称为该生物基因组的文库。cDNAmRNAcDNAmRNAcDNAcDNA随机诱变;指在克隆化基因序列中随机地产生各种突变类型，主要用于诱变基因的编码区，改变氨基酸序列，获得需要的蛋白质。DNA二、简答题段？答：已知某蛋白的核酸编码序列信息，就可以根据该蛋白的核酸编码序列信息PCR，PCR，PCRPCRDNA酸序列片段。已知人类某基因cDNAcDNA。cDNAmRNAcDNAcDNAmRNARNAmRNA③根据已知oligodTPCRcDNAA，然后用oligodToligodTmRNAcDNA，oligodTmRNA长序列⑤测序。列？（注：该物种基因组序列未知）PCR，锚PCR，PCR，PCRRACEPCRDNAT4DNAGSP1,GSP43，14PCRGSP3PCRGSP1GSP4通过对老鼠、猪、猴子等生物分析发现，A蛋白进化保守（域），如何获得人类的A蛋白编码基因？及全长cDNA/mRNA序列？（注：人体中的A蛋白及其基因序列未知）AcDNAA结构域的氨基酸序列及其简并性，和氨基酸对应的遗传密码推测其对应的核苷酸序列，根据不同物种密码子的偏好性对推测的序列进行一定的修正，然后根据该结构域至少六个连续的氨基酸序列人工合成一组混合的寡核苷酸探针，探cDNAAcDNA/mRNA。使用原位杂交筛选阳性克隆子的方法筛选，具体为，基因组文库涂布接种到培养基上进行生长，长出菌落后，使用硝酸纤维素滤膜在培养基表面轻压，使菌斑结合到膜上，然后进行80DNA已经结合在滤膜上然后与探针杂交，进行放射自显影，达到其所处位置与原始AcDNAAcDNA简要描述构建cDNA文库的基本步骤，为何要构建cDNA文库？①RNAcDNAmRNAcDNAmRNA-cDNAcDNA，PCRcDNAcDNAmRNA:cDNARNAaseHmRNA，mRNAmRNAcDNADNAcDNAcDNAcDNAcDNA载体连接转化细胞进行扩增。构建cDNA文库的原因：①研究某些RNA病毒基因组结构及相关基因克隆分离的有效方法。②较cDNA文库复杂度低（约为基因库文库的1/10)、筛选简易。mRNA较低；cDNA（不含内含子），作。⑤能用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。在构建cDNA文库中，如何合成第二链cDNA？3种方法。cDNA/RNAmRNA，cDNAcDNA3（hairpinloop）DNAcDNAS1核酸酶切除将发夹环。cDNAmRNA:cDNARNAaseHmRNA，mRNAmRNAcDNADNAcDNA多个裂口处用连接酶连接起来。③oligoGmRNAcDNA3Oligo(CmRNAcDNAOligo(G)cDNA。与基因组文库相比，cDNA①研究某些RNA病毒基因组结构及相关基因克隆分离的有效方法。②复杂度低（约为基因库文库的1/10)、筛选简易。mRNA较低；cDNA（不含内含子），作。mRNA局限性：①包含的遗传信息远远少于基因组DNA文库。②所含遗传信息受材料来源的影响。③不能直接获得基因内含子序列和基因编码区以外的序列信息。④高丰度mRNA的基因易于分离，而低丰度mRNA的基因很难获得。结合图示说明人工方法合成长片段基因序列的策略（至少写出一种）？何获得足够量的合成片段用于基因克隆？3′DNAI（Klenow）T4DNA连接，形成完整的基因片段。使用化学方法合成小片段，磷酸二酯法；磷酸三酯法；固相亚磷酸三酯法等法5′3当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子，重复多次之后得到一定长度的合成片段简要描述基于PCR的定点突变/诱变策略（至少写出一种）。答：变引物

特殊位置碱基的定点突变（正常引物加突蛋白质相互作用是分子生物学研究的重要内容，也是揭示生命过程中分子调控机制的重要手段之一。试述蛋白质相互作用研究的常用方法及其原理（至少写出两种）。①GSTpull-downGST（GlutathioneStransferase，S-转移酶）GSTGTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。②Co-IP：免疫共沉淀，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员，例如用WB的方法去鉴定。三、论述题1、目的基因的获取方法有哪些？请根据课堂介绍，分情况分层次描述。（1）RT-PCRmRNAcDNA（2)mRNA5‘oligodTRT-PCRPCRPCRNoligodT3’端，中间或PCR,PCR，PCR，PCRRACE离出的蛋白质进行测序，测的蛋白质的氨基酸顺序，然后根据氨基酸与其对应oligodTmRNAPCR（4）人工合成目的PCR（5）突变基因获得所想要的，分为①随机诱变/ab，c，PCRd，嵌套缺失诱变②定点诱变/突变啊。aPCR，b，大引物PCRc，特殊位置的碱基定点突变③DNA（6）想要获得与某个目标性状/组测序，从而获得差异表达基因，对差异表达基因进行扩增实验验证，从而获得某个性状或产物对应的基因（7）以通过染色质免疫共沉淀获得与靶蛋白相互作用的基因，及其序列信息。第五章基因工程载体一、名词解释载体：是一种具有特定功能的DNADNA细胞，并使其在受体细胞中得以维持和表达。表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA件，使外源基因在宿主细胞中有效的表达。质粒：质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体外的可自主复制的遗传成分。松弛型质粒;根据复制的控制和每个细胞中的拷贝数多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒和松弛型质粒，松弛型质粒：拷贝数多，10个拷贝以上。质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象。接合质粒：自然条件下，某些质粒能在细胞间发生转移。质粒能否转移，与其tramobbomnictra粒称为接合质粒。非接合质粒；：自然条件下，某些质粒能在细胞间发生转移。质粒能否转移，tramobbomnictra因的质粒称为非接合质粒。质粒迁移：tramobbomnictra，mobnictra显性质粒：质粒携带一些功能基因，使宿主细胞呈现出新的性状的质粒。质粒载体：以质粒DNA分子为基础构建/改造而成的基因工程载体。温和噬菌体：体。噬菌体载体;利用重组DNA体。cos位点：λDNA一旦进入宿主细胞，黏性末端迅速互补配对形成双链环状DNA分子。这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点。柯斯质粒载体：是一类人工构建的含有λDNAcos型的载体，也称为粘粒载体。病毒载体：借助病毒DNA将外源DNA导入动物细胞的一类载体。Ti质粒：存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中的一种质粒。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒，简称Ti质粒。基因打靶：利用定位整合克隆载体导入外源DNADNADNA基因打靶或基因定位同源重组。二、简答题何为基因工程载体？基因工程载体应该具备哪些基本特性？DNADNA②基因工程载体因具备：A，针对受体细胞的可转移性，即能携带外源基因片段进入受体细胞，并稳定存在。B，在受体细胞中能自主复制，即能在细胞质中自主复制（存在复制起始区），或整合到染色体上随其复制而同步复制。C,易分离纯化。D,有特定的多克隆位点E,能赋予细胞特殊的遗传标记/筛选标记,便于克隆子的筛选。F,表达载体能携带外源基因进入受体细胞并稳定维持和表达，所以还应具有启动子（强启动子）、增强子、SD序列、终止子等；G,必须是安全的，不应该含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人体细胞。型存在？LDNA，OCSCDNA。即使是相同的分子量，迁移率也不相同。SCDNALDNA在。目前应用的基因工程质粒载体都是从天然质粒改造而来，请简要描述构建改造天然质粒作为基因工程载体的基本策略。Ori，复制起始位点。（在受体细胞中有效复制，并有较多拷贝）DNA（MCS），切酶只有唯一的识别位点。（DNA）Tetr、Ampr（子的自然筛选）DNA（DNA）⑤由于特殊需要，在构建的质粒克隆载体时需要组装各种“元件”。简要描述λ噬菌体载体的两种类型和各自的特点。DNA因。DNADNADNADNA什么是柯斯质粒载体？简要描述柯斯质粒载体的基本特征。答：①柯斯质粒载体是一类人工构建的含有λDNAcos殊类型的载体。②特征是：A,DNA10kb;B,性：能象质粒一样在大肠杆菌受体细胞内自行复制与扩增;C,具有λcoscosDNA;DE,具有与同源序列的质粒进行重组的能力.简要描述酵母载体的几种类型及各自的特点。答：①整合型载体，特点：A,通过转化作用，YIpDNAB,转化率低，但是转化子非常稳定。cccDNA但是在受体细胞中不稳定且容易丢失。③着丝粒型载体，特点：在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有1-2个拷贝。④附加体型载体，特点：对酵母有很高的转化活性，相对复制型（Yrp）载体更稳定，拷贝数也更高。SV40②对啮齿动物细胞的感染，不产生具有感染性病毒颗粒，而是病毒基因组整合到寄主细胞的染色体上，细胞会发生癌变，这类细胞称为非受纳细胞，属于非裂解感染。③SV401%-2%SV40-DNADNA，对人较为安全。第六章DNA的体外重组（切与接）一、名词解释全酶：酶蛋白和辅助因子结合形成的具有催化作用的复合物。限制性核酸内切酶：以环状和线形的双链DNA识别一定的核苷酸序列，使每条链中特定位置的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷3′-羟基(-OH)5′-磷酸基(-P)DNA限制修饰系统：细菌等一些原核生物体内存在可保护自身免于外来DNA（如噬菌体）侵入的一个系统。同裂酶酶。同尾酶：酶。黏性末端：DNADNA1DNA平末端：DNADNADNA单酶切：即用一种限制性核酸内切酶酶切DNA样品的酶切方式。双酶切：即用两种不同的限制性核酸内切酶酶切同一DNA分子的酶切方式。部分酶切：即限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全酶切的方式。星号活性：在非理想的条件下，限制性核酸内切酶切割与识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，这一现象称星号活性。DNAligase：DNA5ʹ-磷酸基（5ʹ-P）3ʹ-羟基（3ʹ-OH）间发生缩合反应生成磷酸二酯键的一种酶。碱性磷酸酶：5′-DNARNA5′-P5′-OH无缝克隆：不依赖于连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用同源重组的方法，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。DNA聚合酶：DNARNA4(dATP、dTTP、dGTP、dCTPDNA酶：大肠杆菌DNAI76kDaKlenow反转录酶：RNA4(dATPdTTP、dGTP、dCTPDNADNaseI：一种非特异性的随机水解双链或单链DNA5ʹ带磷酸基的单核苷酸和寡核苷酸的混合物。RNase：一类可以高效降解RNA，且生物活性非常稳定的耐热性核酸酶。末端脱氧核苷酸转移酶：DNA3ʹ-OHT4T4pseTATPDNA(dsss)RNA(dsss)5ʹ-OH二、简答题简要描述细菌中限制修饰系统的特征和作用。DNA对于自身基因的甲基化等化学修饰，以及限制性核酸内切酶存在。核酸内切酶？为何？答：分为三类，分别为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ型。在基因工程中常用的限制性内切酶为Ⅱ型，原因是Ⅰ型限制性核酸内切酶识别位点较为特异，但其切割为识别位点上游1kb以外，切割位点并不特异；限制性核酸内切酶Ⅲ型可以特异的识别碱5-15bp酸内切酶Ⅱ型，有特异的识别序列和酶切位点，因此应用最为广泛。简要描述II型限制性核酸内切酶具有哪些特点？DNADNAMg2+；DNA什么是限制性核酸内切酶的星号活性？哪些因素可能导致星号活性？答：在非理想的条件下，限制性核酸内切酶切割与识别序列的特异性发生改DNADNApH应液中存在有机溶剂（DMSO、乙醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等）；反应中用其他二价离子替代镁离子（Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。什么是DNAligase？简要描述其作用特点。DNA5ʹ-磷酸基（5ʹ-P）3ʹ-羟基（3ʹ-OH）DNA3‘羟5’磷酸基；3ʹ羟基（-OH）5ʹ磷酸基（-P）DNADNAATPNAD+。如何克服基于单酶切的连接反应中的载体自连问题？并简要说明其原理。DNARNA55‘磷酸，使得单酶切处理的载体5’3‘羟基端形成磷酸二脂键从而无法载体自DNA载体自连问题。比较粘性末端连接和平末端连接的异同点，如何提高平末端连接的效率？DNADNA但粘性末端易发生自连。提高平末端连接效率的方法：加大连接酶用量（10大于粘性末端的连接）；加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会；加10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。如何解决不具有互补粘性末端的两个DNA2DNA3‘端polydCpolydG，dCdGDNA补齐。②DNADNADNADNA平末端转换成黏性末端，再行连接？如果能，请描述方案；如果不能，请说明理由？DNA3‘polydCpolydGdCdGDNA转入受体细胞后自动补齐。②DNA末端加上人工合成的含有相应的限制性内切酶识别位点的寡核苷酸或者衔接DNA片段，就可以采用粘性末端的方式进行连接。③同源重组法，引物设计时在5’PCRDNA你认为选用合适的限制性核酸内切酶应该考虑哪些方面？答：①载体上该酶切位点应当唯一，且位于多克隆位点处②外源基因内部不应该有该限制性内切酶位点③该酶的适宜的反应温度应当与构建过程的温度相协调④限制性核酸内切酶具有特异的识别位点和切割位点⑤限制性核酸内切酶在体外具有活性什么叫无缝克隆？简要描述其基本原理。答：①不依赖于连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用同源重组的方法，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。②使外源基因末端具有和载体末端相同源的