浅论hHGF腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

浅论hHGF腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达【摘要】目的：构建人重组肝细胞生长因子(humanhepatocytegrowthfactor，hHGF)基因腺病毒载体(AdHGF),转染人脐带间质干细胞，为转基因治疗提供实验基础。方法：设计含有SalⅠ及XbaⅠ酶切位点的引物，PCR扩增hHGF，将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白又称离散因子，在多种器官和组织中都有着广泛的分布,对多种器官组织有营养修复作用，可促进肝、肾、肺等器官损伤的修复，它也是一种新的神经营养因子［1，2］。HGFY主要通过刺激血管生成，形态发生，抗凋亡，抗纤维化和组织再生作用来发挥它的修复作用。为此我们以HGF为目的基因，构建了绿色荧光蛋白标记的重组腺病毒表达载体，并感染人脐带间质干细胞,为进一步探讨基因修饰后的间质干细胞组织修复作用奠定实验基础。

1材料与方法

材料

菌株、质粒和细胞株

DH5α菌株,BJ5183菌株为本室保存；pAdTrackCMV和pAdEasy1由南京师范大学生命科学院惠赠；人胚肾293A细胞株购自南京凯基科技发展有限公司。

主要试剂

限制性核酸内切酶XbaⅠ，SalⅠ，PmeⅠ,PacⅠ；T4DNA连接酶，ExTaq酶；脂质体Lipofectamine2000；胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒。

主要仪器

CO2培养箱(Forma,Scientific公司)，倒置式生物显微镜(TE300,Nikon公司),PCR仪(ABI2720)，核酸蛋白检测仪(Biophotometer,Eppendorf公司)，全自动凝胶成像系统(Syngene,Gene公司)。

方法

PCR引物设计

采用PrimerPremier软件设计两对引物用于扩增hHGF基因，在每条引物的前端加入相应的限制性酶切位点和保护性碱基，上游引物为SalⅠ：5′AAGTCGACATGTGGGTGACCAAACTCCT3′；下游引物为XbaⅠ：5′CCTCTAGACTATGACTGTGGTACCT3′，扩增长度为2169bp。

TA克隆及测序以人胎肝组织为模板，提取RNA并逆转录为cDNA。用设计的hHGF上下游引物进行PCR扩增，反应体系为25μl，其中含10×PCR缓冲液μl,dNTP(μmol/L)μl，模板质粒(200μg/ml)μl，上下游引物各μl，ExTaqDNA聚合酶μl，用ddH2O补足至25μl。热循环程序为94℃5min,94℃60s，66℃60s，72℃3min，30个循环后72℃再延伸10min。

将获得的hHGF片段克隆到PGEMT载体上，转化感受态细菌DH5α。操作将TA克隆的载体加入感受态细菌DH5α，置于冰上30min，然后转入42℃水浴热激90s，再置于冰上2min，然后加入预冷的LB培养基至700～800μl，放入37℃恒温摇床，200r/h，然后涂氨苄西林LB平板，置37℃恒温培养箱过夜。次日，挑选生长较好的单个菌落，分别置于3mlLB培养基，37℃恒温摇菌12h，然后用小量质粒提取试剂盒提取质粒。

将提取的质粒通过PCR和XbaⅠ、SalⅠ双酶切验证。酶切体系：质粒μg，缓冲液1μl，牛血清白蛋白μl，SalⅠμl，XbaⅠ2μl，ddH2O补足至10μl，置于37℃水浴过夜。PCR和双酶切产物均进行琼脂糖凝胶电泳。将TA克隆阳性的菌液送上海生工生物工程公司测序。

重组穿梭质粒pAdTrackCMVHGF的构建

将TA克隆阳性质粒和穿梭载体pAdTrackCMV同时用XbaⅠ、SalⅠ双酶切，双酶切反应体系：TA克隆质粒/穿梭质粒μg，缓冲液5μl,牛血清白蛋白μl，XbaⅠ1μl，SalⅠ1μl，ddH2O补足至50μl，37℃水浴过夜。琼脂糖凝胶电泳观察并切胶回收，分别获得kb和kb的基因片段。纯化后，将目的基因片段与载体经T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接反应体系：缓冲液2μl，目的基因片段μg，穿梭质粒μg，T4DNA连接酶1μl，补充双蒸水至20μl，将HGF片段插入穿梭质粒中的相同位点，转入大肠埃希菌DH5α中，涂卡那霉素LB平板，挑选4～6个单个菌落，摇菌过夜，小提质粒，经XbaⅠ、SalⅠ双酶切及PCR验证挑取阳性克隆，获得重组穿梭质粒pAdTrackCMVHGF。

同时构建不含融合基因的空腺病毒质粒pAdGFP作为对照。

重组腺病毒质粒pAdGFPHGF的构建及鉴定

取1μlpAdEasy1质粒转化BJ5183感受态细菌，挑取克隆，经酶切鉴定正确后命名为BJAdEasy，常规氯化钙法制备BJAdEasy感受态细菌备用。将重组穿梭质粒pAdTrackCMVHGF用PmeⅠ酶切线性化，酶切体系：缓冲液2μl，牛血清白蛋白μl，重组穿梭质粒μg，PmeⅠμl，ddH2O补足至20μl，37℃水浴过夜，转入BJAdEasy感受态细菌中，使pAdEasy1与pAdTrackCMVHGF在BJ5183中重组。卡那霉素筛选，挑取15～20个克隆，接种后振摇过夜，提取质粒，用PCR法鉴定初筛重组子，再用PacⅠ酶切鉴定，体系为缓冲液1μl，牛血清白蛋白μl，重组腺病毒质粒μg，PacⅠμl，ddH2O补足至20μl，37℃水浴过夜，鉴定正确后得到阳性克隆，再将其转入大肠埃希菌DH5α中，大量扩增。

重组腺病毒AdGFP/HGF的转染包装及扩增

将重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后，脂质体转染293A细胞。转染前2h将293A细胞置于无血清培养液中，PacⅠ线性化重组质粒10μg用无血清培养液稀释至100μl、脂质体5μg用无血清培养液稀释至100μl，两者轻轻混匀，室温静置30min后加入60%～80%融合的293A细胞中，6h换正常培养液继续培养，24h可见绿色荧光，72h后收集293A细胞，-70℃和37℃反复冻融3次，裂解细胞，离心收集病毒。取适量病毒液加入到70%融合的293A细胞中，37℃、5%CO2孵箱中培养，镜下可见较强的绿色荧光及细胞病变。将病毒液反复感染293A细胞3次，大量扩增病毒，测定病毒滴度，-70℃保存备用。

重组腺病毒AdGFP/HGF的滴度测定

细胞准备：收集1瓶293A细胞，计数；用2%FBS的DMEM准备105/ml细胞20ml；在2块96孔板中加入100μl细胞悬液。第1管中加入mlDMEM2%FBS，FBS其余加入ml。第1管中再加入ml病毒保存液；上下吸打5次，换用新枪头；从第1管中吸取ml加入第2管；反复稀释到最高稀释度；同一管病毒保存液进行第2轮稀释；最后8个稀释液加入96孔板，每孔ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照；阴性对照孔加入ml2%FBS的DMEM监测细胞存活情况；加样从最高稀释度开始；37℃培养10d。10d后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现细胞病变的孔数。

重组腺病毒AdGFP/HGF感染hucMSCs

选择生长状态良好hucMSCs,至细胞80%融合。感染前2h换新鲜培养液，按照感染复数15000，加入病毒液24h后荧光显微镜下可见荧光，48h时可见70%以上hucMSCs带有绿色荧光。

2结果

重组穿梭质粒pAdTrackCMVHGF的鉴定

重组穿梭质粒经PCR鉴定，可见到2200bp的目的基因片段；用XbaⅠ、SalⅠ双酶切验证阳性克隆，电泳可见约9000bp和2200bp两个片段，与相应载体及目的片段的大小相符合。

重组腺病毒质粒pAdGFP/HGF的鉴定

重组腺病毒质粒用PacⅠ酶切验证完全重组腺病毒质粒，酶切可见30000bp和4500bp大小的片段；XbaⅠ、SalⅠ双酶切进行验证，证实含有目的基因片段。

重组腺病毒AdGFP/HGF转染293A细胞

通过GFP的表达可观察重组腺病毒在293A细胞内的转染情况。在荧光显微镜下，可见293A细胞几乎100%表达GFP。

重组腺病毒AdGFP/HGF滴度测定

经过测定AdGFP/HGF的滴度为×1010pfu/ml，AdGFP的滴度为×1010pfu/ml，病毒滴度较高，符合后续实验的要求。

重组腺病毒AdGFP/HGF感染hucMSCs

用重组腺病毒感染hucMSCs，24h后可见GFP微弱表达，48h后荧光强度明显增强，表达GFP的细胞达70%以上(图4)。

3讨论

HGF对肝脏损伤修复作用的研究比较深入，HGF对多种肝脏疾患有治疗作用［3-5］。近年来研究表明，HGF在诸多重要器官和组织的创伤修复中起着关键作用，特别是在某些脏器损伤防治中也有着很好的效果［6-9］。

重组腺病毒载体作为介导基因转染和表达的重要工具，与其他载体相比，有如下优点：①基因组的结构和功能清楚，允许大分子插入；②没有外膜，结构稳定，对介导相关的灭活作用不敏感；③复制缺陷的腺病毒由于没有基因重组情况的发生，不引起宿主的细胞癌变；④可以进入不分裂的细胞或终末分化细胞；⑤在宿主细胞内具有很高的拷贝数，而且容易浓缩制备。本研究选用的腺病毒重组系统，带有GFP报告基因，可在荧光显微镜下直接观察、判断基因转染的成败和效率，具有简单、直观的优点。

间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有多向分化潜能和向损伤组织趋化的特性，免疫原性低，下调免疫应答［10］，是理想的组织工程细胞和基因治疗的载体细胞。本实验室从脐带中成功培养出MSCs，其生物学特性与骨髓MSCs无显着的差异，较骨髓MSCs更易于分离、培养和扩增［11］。因此，本研究选用hucMSCs作为基因治疗的载体细胞，为以后深入研究和临床应用提供了可能。

本研究表明，构建的AdHGF含有能够有效表达的HGF基因，基因序列分析结果显示此表达系统含有完整的HGFcDNA。同时，表达系统的开放阅读框没有发生错位。使用构建的AdHGF表达系统转染293细胞后,荧光显微镜可以观察到AdHGF表达系统能够成功地在此细胞内表达，得到高滴度的病毒液。重组腺病毒可感染hucMSCs且效率较高,HGF基因在hucMSCs中获得表达,这为进一步研究基因修饰hucMSCs的组织修复提供了实验基础。

【参考文献】

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