化工原理实验教学大纲

.子生物学综合实验》实验教学大纲立设课物化学生物化学与分子生物学综合实验的实验课是在学习生物化学与分子生物学理论课的基础上进行的一个实践性环节，本课程的教学任务是让学生运用已学过的知识验证一些结论、技能、仪器仪表的使用能力、实验数据的处理和分析能力。本实验课配合理论教学，通过实验从实践中进一步学习，掌握和运用学过的基本理论；和解决问题的能力。学生必须完成的基本要求：准备实验，预习实验；写出预习报告，拟定记录表格；测取实验数据；整理实验数据；写出实验报告。及办法考核方式：考查。实验成绩评分办法：实验技能占40%，实验态度占20%，实验报告占生物化学与分子生物学综合实验项目一览表求1量测定(双缩脲法)类类32量测定(紫外吸收法)类类33类64类35类36PCR电泳检测类67SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白类6...1、本次实验的目的和要求2、实验容或原理ml蓝色，颜色随蛋白质浓度的增加而加深，在595nm波长下光吸收和蛋白质浓度成正比。3、需用的仪器和试剂4、实验步骤标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。7、实验报告要求包括下列各项：(1)报告的题目(要简明确切)；(2)写报告人及共同测定人员的；(3)实验目的；(4)实验原理；(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称)；(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格)；(7)实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。(8)分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；(9)回答思考题。实验二蛋白质含量测定(双缩脲法)1、本次实验的目的和要求学习和掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。比较不同方法测定蛋白质含量的异2、实验容或原理碱性溶液中双缩脲(NH-CO-NH-CO-NH)能与Cu2+产生紫红色的络合物，这一反应称为“双22质含量在一定围符合朗伯-比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。其可测定围为1~10mg蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。Tris，一些氨基酸，EDTA等会干扰该测定。...3、需用的仪器和试剂4、实验步骤标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。7、实验报告要求包括下列各项：(1)报告的题目(要简明确切)；(2)写报告人及共同测定人员的；(3)实验目的；(4)实验原理；(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称)；(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格)；(7)实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。(8)分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；(9)回答思考题。蛋白质含量测定(Folin酚试剂法)1、本次实验的目的和要求掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理方法，熟悉分光光度计的操作。比较不同方法测定蛋白质含量的异同。2、实验容或原理Folin-酚法测定蛋白质含量的过程包括两步反应:第一步是在碱性条件下蛋白质与CuSO4作用生成络合物，第二步是此络合物还原Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)，生成深蓝色的化合物，且颜色深浅与蛋白质的含量成正比关系。该方法灵敏度高于双缩脲法100倍。3、需用的仪器和试剂分光光度计、水浴锅、试管、具塞试管、小烧杯、漏斗及架、电子天平、吸管、容量瓶、n4、实验步骤标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。7、实验报告要求...包括下列各项：(1)报告的题目(要简明确切)；(2)写报告人及共同测定人员的；(3)实验目的；(4)实验原理；(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称)；(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格)；(7)实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。(8)分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；(9)回答思考题。实验四蛋白质含量测定(紫外吸收法)1、本次实验的目的和要求含量的异同。2、实验容或原理蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等残基在280nm波长下具有最大的吸收。由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的吸光度是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可用作蛋白质定量测定。3、需用的仪器和试剂紫外分光光度计，离心机，电子天平，研钵，容量瓶，刻度吸管4、实验步骤(2)根据公式计算出蛋白质含量：蛋白质(μg/ml)=(1.45A-0.74A)×稀释倍数2802605、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。7、实验报告要求包括下列各项：(1)报告的题目(要简明确切)；(2)写报告人及共同测定人员的；(3)实验目的；(4)实验原理；(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称)；(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格)；(7)实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。(8)分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题...应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；(9)回答思考题。实验五淀粉酶活力测定1、本次实验的目的和要求学习酶活力测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。2、实验容或原理淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶。α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1，4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极pH使其钝化。β－淀粉酶从非还原端作用于α-1，4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1，6键时停止。单通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定(α+β)淀粉酶总活力，就可求出β-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3，5-二硝基水酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3，5-二硝基水酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水酸，生成物颜色3、需用的仪器和试剂电子天平、研钵、容量瓶、具塞刻度试管、吸管、离心机、恒温水浴、分光光度计1%淀粉溶液、柠檬酸缓冲液、NaOH、3，5-二硝基水酸、麦芽糖标准液(1mg/ml)4、实验步骤(1)酶液提取n(2)标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达1.0ml，再各加3，5-二硝基水酸试波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量m(g)为横坐标，绘制标(3)α-淀粉酶活力测定用流水冷却。...n(4)淀粉酶总活力测定-淀粉酶测定第⑸步的操作，同样准备测糖。塞刻度试管中，各加入1ml3，5—二硝基水酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。7、实验报告要求包括下列各项：(1)报告的题目(要简明确切)；(2)写报告人及共同测定人员的；(3)实验目的；(4)实验原理；(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称)；(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格)；(7)实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。(8)分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；(9)回答思考题。1、本次实验的目的和要求2、实验容或原理A复性，互相缠绕，在离心时极易和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来。转移出上清液，再以具有质粒pETblue-2的大肠杆菌实验材料，用碱性SDS法可从该菌体中提取到质粒...DNA，经琼脂糖凝胶电泳可以检测出。3、需用的仪器和试剂高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温振荡摇床、台式高速离心机、真空干燥器、低温冰箱、恒温水浴、移液器、LB培养基、羧苄青霉素(Carb)、四环素(tet)、TE、溶4、实验步骤(1)先在3mLLB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(Carb,终浓度50ug/mL)和7.5uL(2)将过夜培养的菌液加入1.5mL小指管管中，4000r/min离心1分钟，吸去培养液将所有菌体细胞收集在一个小指管中。(3)加入100μL溶液I于含菌体细胞的小指管中，旋涡振荡将细菌沉淀悬浮，室温放(4)加入200μL溶液II(新鲜配制)，轻轻混匀容物，将小指管置于冰上使菌液裂解变清(不可用旋涡震荡器)。(5)加入150μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口，轻轻混匀数次。冰上放置15分钟让质粒DNA复性(不可用旋涡震荡器)。(7)向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(去蛋白和脂类)，旋涡混匀，12000r/minL(8)向上清中加入等体积氯仿：异戊醇(去微量酚和脂类)，旋涡混匀，12000r/min离(10)用1mL75%乙醇洗涤质粒DNA沉淀两次(每次12000r/min离心5分钟)，吸去上清液，真空抽干或空气中干燥。LTEDNA完全溶解，－20℃保存。5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。7、实验报告要求包括下列各项：(1)报告的题目(要简明确切)；(2)写报告人及共同测定人员的；(3)实验目的；(4)实验原理；(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称)；...(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格)；(7)实验结果。明确提出本次实验的结论(8)回答思考题。1、本次实验的目的和要求掌握电泳鉴定的基本操作技术，为从事基因工程和分子生物学研究奠定初步基础。2、实验容或原理电荷，在电场中向正极移动，电泳后，核酸在凝胶中的位置通过“染色”来显现。3、需用的仪器和试剂琼脂糖、标准分子质量DNA、上样缓冲液(6×loadingbuffer)、TAE、GoldView电泳仪、水平电泳槽、移液器4、实验步骤(1)将有机玻璃槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。(2)将有机玻璃槽放置于水平位置，并放好样品梳子。(3)将称取0.25g琼脂糖放入三角瓶中，加入25mL1×TAE，用封瓶膜封住三角瓶的上将琼脂糖溶化。(4)待冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液时，加入2μLGoldView核酸染料，轻轻混匀，将(5)待胶液凝固后，取下橡皮膏，将机玻璃槽放入电泳槽。(6)加入电泳缓冲液(1×TAE)至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面，轻轻取出梳子。(7)加样：DNA样品中按照5：1的比例添加6×凝胶加样缓冲液(loading-buffer)，混(8)电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，恒压80V(注意正负极，DNA片段从负极向正极胶前沿1~2cm处，停止电泳。nmDNA及亮度。5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。7、实验报告要求包括下列各项：...(1)报告的题目(要简明确切)；(2)写报告人及共同测定人员的；(3)实验目的；(4)实验原理；(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称)；(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格)；(7)实验结果。明确提出本次实验的结论；(8)回答思考题。实验八聚合酶链式反应(PCR)技术及电泳检测1、本次实验的目的和要求2、实验容或原理然后退火，使特征引物与互补序列配对，最后在TaqDNA聚合酶的作用下合成DNA片段，经年Saiki等从真细菌ThurmasaquticusrT1中开发出热稳定的TaqDNA聚合酶并实现PCRPCR技术可在一个酶促反应中产生大量已知序列的DNA片段，简化了克隆、鉴定、修饰核酸等程序。正是因为具有如此快速、简便、经济、高效的特点，使得PCR技术成为分子生物学研究强有力的技术工具。(1)模板：阳性对照(2)Taq酶：(3)引物1(4)引物2(5)dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)(6)电极缓冲液TAE：Tris-乙酸r3、需用的仪器和试剂泳缓冲液(1×TAE)、琼脂糖、Goldview、DNAMarkers(标准DNA)4、实验步骤...PCR扩增目的基因(碱性磷酸酶AKP)(1)在0.2mLPCR管配制50μL反应体系2.5mmol/LdNTPMixture4uL10xPCRbuffer5uL10umol/mLsense2uL10umol/mLanti-sense2uL模板DNA1uLEx-Taq1uL(1U)ddH2O35uL(2)按下述程序进行扩增预变性5分钟2)94℃变性1分钟3)55℃退火1分钟4)72℃延伸2分钟(3)琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。7、实验报告要求包括下列各项：(1)报告的题目(要简明确切)；(2)写报告人及共同测定人员的；(3)实验目的；(4)实验原理；(5)实验仪器和试剂(包括主要仪器的规格、主要试剂的名称)；(6)实验数据记录(包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格)；(7)实验结果。明确提出本次实验的结论。(8)回答思考题。实验九SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量1、本次实验的目的和要求...2、实验容或原理动得越快；反之越慢。和形状。如果用还原剂(如巯基乙醇或二硫糖醇等)和十二烷基硫酸钠(SDS)加热处理蛋结构呈长椭圆棒状。由于与蛋白质结合的SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量负电荷，蛋白质分离方法，也是一种十分有用的测定蛋白质分子质量的方法。应该注意的是，SDS-应其状态下的分子质量及分子中肽链(亚基)的数目。3、需用的仪器和试剂恒压电泳仪、垂直板电泳槽、注射器、加样器、烧杯、下层胶缓冲液、上层胶缓冲液、Acr+Bis贮备液、10%过硫酸铵、样品缓冲液(裂解液)、电极缓冲液、染色液、脱色液、子量标准蛋白”、牛血清白蛋白、鸡血清4、实验步骤(1)电泳槽的安装：玻璃板先用洗液浸泡，再用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，垂直地固定在两半槽之间，对角拧紧。电泳槽装好后，将溶化的1.5%的琼脂注入背面(2)样品的处理：将标准蛋白质样品及未知样品分别配制浓度为2mg/ml的溶液，溶剂为SDS样品处理液，溶解后在沸水浴中加热3-4min。冷却后待用。(3)制胶：将胶沿玻璃壁缓慢加入已准备好的凝胶(在注胶过程中防止产生气泡)，胶水层之间形成清晰的界面。分离胶聚合好之后，吸去分离胶上的水层，注入浓缩胶，同时插入梳子。其下端应具1cm，待胶聚合好后小心的取出梳子。(4)点样：标准分子量蛋白：将标准分子量蛋白溶于SDS样品缓冲液中(1-2mg/ml)在沸水浴中...未知样品：将提取的未知分子量蛋白用处理标准蛋白的方法处理之。在两槽加入电极缓冲液，用微量进样器将已知分子量的标准蛋白质混合物加入到一样品槽，将未知样品加入到其他样品槽。(5)电泳：加样接通电源后立即电泳(上槽接负极，下槽接正极)，最初控制在15mA，当样离胶底部1-2cm时可停止电