病毒-病毒感染的检测方法（动物微生物）

病毒感染的检查方法电镜技术血清学试验分子生物学技术病毒的分离鉴定标本采集与送检一、标本采集与送检原则：1.尽早采取：发病初期

2.部位适宜：由感染部位采取

3.冷藏速送：装有冰块或干冰的容器内（一）供分离病毒、检出核酸及抗原的标本（二）检测特异性抗体的标本

采集双份血清，4-20℃保存病毒材料采集与检验结果的关系采取标本的时期检查病毒及其成分测定抗体潜伏期及前驱期刚发病或急性期恢复期及康复期较难查见最多查见很难查见未增多未增多或增多不明显明显增多（常超过4倍）病毒分离是诊断病毒感染的金标准，一旦阳性，即可确诊。不适用于快速诊断，操作复杂，实验成本高，阳性检出率低等。有时不得不分离病毒，例如发现了一种新的病毒病，必须分离病毒进行研究，或者分离株的鉴定对流行病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望获得天然弱毒株等。二、常规分离与鉴定（一）病毒分离标本采集杀灭杂菌（青链霉素）接种鉴定病毒种型易感动物出现病状鸡胚病变或死亡细胞培养细胞病变三大方法（二）病毒鉴定1.形态学鉴定观察CPE。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。正常细胞病变细胞感染细胞具有吸附红细胞的能力感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用2.血吸附和血凝作用多见于以出芽方式释放的病毒。红细胞吸附正常细胞（1）血吸附作用吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定具有吸附特性的病毒（2）血凝作用血凝试验血凝抑制试验（3）病毒成分的直接检测用免疫学或分子生物学技术直接检查感染细胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。三、电子显微镜检查病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。透射电子显微镜1.正染法：超薄切片法取材固定戊二醛四氧化锇清洗与脱水浸透包埋聚合切片染色铀染铅染鸡痘病毒（超薄切片）超薄切片法的优缺点：优点：可观察病毒形态和形态发生过程缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存2.负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。铜网样品

滤纸染液（常用磷钨酸）1-2分钟后电镜观察口蹄疫病毒的电镜负染负染法的优缺点：优点：快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰地病毒结构缺点：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有样品应处于悬浮状态免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。

3.免疫电镜技术(Immuneelectronmicroscopy，IEM)（1）免疫凝集电镜技术抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性质。（2）免疫电镜定位技术特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。

酶标记染色

四、血清学试验是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用ELISA、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。virus1.中和反应观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。2.补体结合反应AgAb红细胞溶血素补体AbAg红细胞补体溶血素溶血（-）不溶血（+）3.免疫扩散

4.酶联免疫吸附试验（ELISA）将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。（1）间接ELISA（2）夹心ELISA3′3′5′5′3′3′3′3′3′3′5′5′5′5′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′模板DNA双链形成新的双链DNA退火变性五、分子生物学技术聚合酶链反应（PCR）2.核酸杂交技术核酸探针（probe）是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，可检测待检样品中特定的基因顺序。六、感染组织的组织学检查病毒在光学显微镜下无法看到，但是在某些病毒感染细胞内出现包涵体，或者细胞形态发生变化，则对诊断有重要意义。如Negri氏包涵体是狂犬病犬脑细胞的特征。病理组织或渗出液作成涂片检查包涵体时，常用苏木紫-伊红染色法。狂犬病毒包涵体（Negribody）一、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体---用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体及抗体水平。二、实验目的掌握HA和HI试验基本原理。掌握1%红细胞配制方法；掌握HA试验操作步骤和结果判定方法；掌握四单位病毒配制的计算方法；掌握HI试验操作步骤和结果判定方法。

血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验三、实验材料

实验器材：

移液器（50ul）、枪头和枪头盒、枪架

禽类采血器、碘伏棉球、酒精棉球

离心机、离心管

小烧杯、大烧杯

96孔v型反应板、振荡器

实验试剂：

新城疫病毒抗原、阳性血清、阴性血清与待检血清、生理盐水、抗凝剂96孔v型反应板振荡器新城疫病毒抗原

新城疫阳性血清

四、实验原理（一）HA原理：某些病毒的血凝素纤突,能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（hemagglutination，HA）,也称直接血凝反应（红细胞不流淌）,利用这种特性设计的试验称血凝试验。病毒颗粒红细胞（二）血凝抑制试验（HI）原理：当病毒悬液（抗原）中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒的血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。Iamlate！抗体抗原红细胞抗原抗体结合

五、1%鸡红细胞液的制备采血：用注射器吸取枸橼酸钠抗凝剂0.5mL，采血约2～4mL，轻轻混合均匀，拔下针头，将血液注入15ml离心管中，加3-4倍体积生理盐水。洗涤鸡红细胞3~5次：将离心管中的血液经2000r/min离心5~10min，弃上清液。沉淀物加入生理盐水，轻轻混合，再经2000r/min离心5~10min，用移液器移去上清液及沉淀物上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，制得红细胞泥。1%鸡红细胞悬液配制：吸取压积红细胞泥与生理盐水以1:99进行配制1%鸡红细胞悬液。取50ml烧杯，加入19.8ml生理盐水，吸取200ul红细胞泥注入烧杯中，用1ml移液器反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀，备用。注意：制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血，不可再使用。红细胞上层为上清液，下层为沉淀物血凝试验（HA)操作步骤：1、在96孔V型反应板上第一排的1－12孔内各加入25ul生理盐水，换枪头。2、吸取25μL病毒悬液加入第l孔，枪头浸于液体中缓慢吹吸3-5次，使之充分混匀；从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，充分混匀后吸取25μL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃之，换枪头。3、在1－12孔每孔再加入25ul生理盐水，换枪头。4、在1－12孔中，每孔加入25ul的1％鸡红细胞悬液（注意：将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。5、将96孔V型反应板置于振荡器上振荡1min或轻叩反应板混合反应物，放于室温（20～25℃）或37℃中静置30～40min。当第12孔红细胞对照孔（C孔）红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底时判定结果。6、HA结果判定：能使红细胞100%凝集的病毒最高稀释倍数为该病毒的血凝效价。六、血凝试验（HA)

②③④①生理盐水/ul生理盐水/ul血凝试验操作步骤HA结果判定标准：血凝程度用++++、+++、+++、++、+、-表示。++++：红细胞完全凝集，即红细胞100%凝集，凝集的红细胞在孔壁上铺成薄膜状，无红细胞沉积在孔底。如第一排第1-7孔红细胞都是100%凝集。

+++：大部分红细胞凝集，凝集的红细胞在孔壁上铺成薄膜，面积较大；但尚有少部分红细胞（约25%）未凝集，未凝集的红细胞沉积在孔底中心形成小红点。如第一排第8孔。

++：约有半数红细胞凝集，凝集的红细胞在孔壁上铺成薄膜，面积较小；未凝集的红细胞（约50%）沉积在孔底中心聚成小圆点。如第一排第9孔。+：只有少数红细胞凝集；未凝集的红细胞（约75%）沉积在孔底中心聚集形成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆盘周围。如第一排第10孔。-：红细胞不凝集，沉积于孔底，形成一圆盘状或钮扣状，边缘整齐。如第12孔、11孔。HA结果判定根据HA的试验结果配制4血凝单位病毒抗原（4HAU）。即以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例：HA试验中完全血凝的病毒最高稀释孔是第7孔，则完全血凝的病毒最高稀释倍数:1：27（1：128），则4个单位抗原的稀释倍数为:1：32（128除以4）。若需配制总体积为32ml的4单位病毒，加入1ml病毒抗原和31ml的生理盐即可（即：将病毒抗原稀释了32倍）。

六、4单位病毒的制备血凝抑制试验操作步骤：1、取96孔V型反应板，在1～12孔内各加入25ul生理盐水，换枪头。2、吸取25μL血清加入第1孔内，枪头浸于液体中缓慢吹吸3-5次，使之充分混匀后吸取25μL移加至第2孔，如此依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL弃去。3、在第1～11孔均加入4HAU病毒液25μL，第12孔加25ul生理盐水。第11孔为阳性对照孔，第12孔为阴性对照孔。4、轻轻震荡混匀，室温（20～25℃）静置30min。5、在第1～12孔每孔均再加入1％鸡红细胞悬液25ul；6、轻轻振荡均匀，置于室温或37℃中静置30～40min，阴性对照孔红细胞呈现钮扣状沉于孔底。7、结果判定。以完全抑制4HAU病毒抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI效价。

七、血凝抑制试验（HI）移液器常用于实验室少量或微量液体的移取，规格不同。不同规格的移液枪配套使用不同大小的枪头，不同生产厂家生产的形状也略有不同，但工作原理及操作方法基本一致。移液器属精密仪器，使用及存放时均要小心谨慎，防止损坏，避免影响其量程。移液器的原理及使用一、实训目的：了解移液器的原理；掌握移液枪的正确使用方法。熟悉移液器的维护保养。二、实训内容：移液器的结构移液器的分类移液器的使用方法移液器的维护和保养移液器的原理及使用容量调节旋纽手指把手

枪头脱卸按钮容量显示窗吸头排出器套筒吸头圆锥体（一）移液器的结构

（二）移液器的分类

移液器按工作原理可分为：气体活塞式移液器（常用）外置活塞式移液器气体活塞式移液器1原理：活塞通过弹簧的伸缩运动来实现吸液和放液。2加样体积范围：1μL~10mL3.实验室常用移液器规格：5-50μL量程；20-200μL量程；200-1000μL量程；1-

10mL量程（备注：每种均附上图片）

3缺点:不适宜移取高粘稠度液体、挥发性较大的液体。易发生交叉污染。错误的使用习惯易造成移液器精度不准甚至移液器内部腐蚀等。吸嘴（一次性）套筒活塞死体积液样气体活塞式移液器外置活塞式移液器这种移液器是采用外置式活塞，活塞设计在吸头内部，直接与液体接触，活塞与液体之间没有空气段。适用于粘度比较大或者产生气泡的液体的操作。无空气间隔，避免了样品于空气接触可能发生的气雾交叉污染，因此也非常适合是珍贵的试剂、生物样品的移取。外置活塞式移液器（三）移液器的使用方法一个完整的移液循环：容量设定--量程的调节枪头安装预洗枪头吸液放液卸去枪头1.容量设定--量程的调节在设置量程时，所设量程须在移液器量程范围内，不要将按钮旋出量程，否则会卡住机械装置，损坏了移液器。调节所需容量时一般由大体积处向小体积处旋转，以保证移取的最佳精确度。从大体积调节至小体积时，为正常调节法，调节到刚好就行；例如：从50ul调至25ul--直接从50ul调至25ul即可。从小体积调节至大体积时，就需要先调节超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，可保证最佳的精确度。（这是由于计数器里面有一定的空隙，需要弥补）。例如：从25ul调至45ul---先从25ul调至46ul，再从46ul调至45ul。2、枪头安装枪头正确的安装方法为旋转安装法：将移液枪(器)垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。注意：在将枪头套上移液枪时，有的使用者会使劲地在枪头盒子上敲几下，这是错误的做法，因为这样会导致移液枪的内部配件(如弹簧)因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，严重情况下会将白套筒折断。注意：枪头与移液器应匹配，选择与移液器匹配的，有质量保证的枪头。枪头与移液器不匹配，会影响气密性。3、预洗枪头在安装了新的枪头或增加了容量值以后，应把需要转移的液体吸取、排放两到三次。液体可以通过枪头预润湿的方式来达到精确移液，先吸入样液，打出，枪头内壁会吸附一层同质液膜，使表面吸附达到饱和，然后再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。4、吸液正确的吸液方法：垂直吸液：吸取液体前，先用大拇指将按钮按下至第一停点，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下，然后慢慢松开按钮回原点，取出移液器。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴。注意：吸液速度需缓慢。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。吸液时枪头浸入液面深度：移液器规格不同，吸头浸入液面深度要求不同。

移液器规格吸头浸入液面深度50µL和100µL2-3mm200µL和1000µL3-6mm

10mL6-10mm