临床分子生物学检验

PAGEPAGE10/111～61、现代分子生物学的开端：1953，WatsonCrickDNA标志着现代分子生物学的兴起，为揭开人类生命现象的本质奠定了基础。2、临床分子生物学检验：是分子生物学技术在临床检验诊断应用中发展起来的，以疾病为中心、以生物分子标志物为靶标的新一代临床检验诊断技术，是临床分子生物学的重要组成部分。3、应用到临床的分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物。4、分子标志物：是指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质（多肽）、代谢产物等生物分子，是生物标志物的一种类型。5、核酸分子标志物包括：基因突变，DNADNARNA环核酸等多种形式。6、DNA（核苷酸）：DNA7、DNA（右手螺旋—B—Z）：DNA是双螺旋结构，主要特征是①主干链反向平行：DNA5’→3’3’→5’基构成链的骨架，位于双螺旋的外侧；碱基位于双螺旋的内侧。碱基平面与中轴垂直。②侧链碱基互补配对：两条脱氧多核苷酸链通过碱基之间的氢键连接在一起。DNA2nm，10（20核苷酸），0.34nm，3.4nm，每个碱36°。8、DNA（DNA）：DNADNA见的形式。9DNA（4）：①形成核小体：构成染色质的基本单位是核小体。核小体由核小体核心和连接区组成。核小体核心由组蛋白八聚体（H2A,H2B,H3，H4）146DNAH1DNA相连成串珠状染色质细丝；③染色质细丝螺旋化形成染色质纤维；④染色质纤维进一步卷曲、折叠形成染色单体。（核小体、螺旋管、超螺旋管、染色体单体）10、原核生物和真核生物mRNA的相同点和异同点？表1 原核生物和真核生物mRNA的异同点项目原核生物真核生物结构多顺反子单顺反子翻译起始和终止点个数多个1个加工修饰很少加工5’端有帽子结构，3’端有多聚腺苷酸尾巴转录与翻译同时进行核内转录，胞质内翻译相同点：①RNA5’-3’A、G、C、UDNARNA11、细胞总RNA中主要是rRNA（80%左右）。12、miRNA：miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20-25个核苷酸，在细胞内主要发挥基因转录后水平调控作用。13RNA列，是核酸分子的功能单位。基因结构=编码序列+调控序列（强子，终止子等）。145’DNADNA15DNA可遗传的变化。表观遗传现象包括：组蛋白修饰、DNARNA表观遗传学：是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。16、常见的组蛋白修饰包括：甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化，糖基化等。17、DNADNAS-为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNACpG5-甲基胞嘧啶。点突变：也称为碱基置换，是指单个碱基的改变，在引起人类遗传性疾病的点突变中包括错义突变、无义突变、RNA加工突变以及发生在调控区的突变等。18、错义突变：是指点突变改变了三联体密码子，导致基因产物中某个氨基酸被另一个氨基酸所取代。19DNA止密码子破坏，导致翻译延续到下一终止密码子才停止，使得肽链延长。20、质粒：是指细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。质粒是自行复制单位，有多个拷贝者，称为松弛型质粒。仅含一个或几个拷贝者，称为严紧型质粒。21、转座因子：又称转座元件，是一类在细菌染色体，质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。22、人类基因组包括细胞核内的核基因组和细胞质内的线粒体基因组。核基因组由3.0×109bp组成，线粒体基因组由16569bp组成。23、多基因家族：是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。为假基因。DNA1000（2500）1%时，则称为多态性。24、单核苷酸多态性(SNPs)：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。25异源核酸形成双链杂交体的过程。26、核酸分子杂交的基本原理：DNA力.在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNADNADNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的中点被称作融解温DNA27、探针的标记方式：随机引物标记，DNA缺口平移标记，全程RNA探针标记，化学法全程标记，3’末端标记和5’末端标记P4028、核酸分子杂交的类型：液相杂交，固相杂交，原位杂交，而固相杂交又可以分为菌落杂交、点/狭缝杂交、反向点杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。29、Southern：SouthernDNADNADNADNADNA移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结DNA30、SouthernNorthernSouthernDNANorthernRNA。31、原位杂交：是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位的检测技术。32、聚合酶链反应（PCR）技术由美国的K.Mullis博士于1983建立。33、PCRPCRDNAPCRDNA3DNA片段在高于其熔点温度（Tm）件下（94～95℃）DNA链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合；②退火：退火的目的是将反应体系的温度降低至寡核苷酸（引物）的熔点温度以下（40～70℃），以便使引DNA723’TaqDNADNAPCRDNA30230（109）p6034PCRdNTP、TaqDNA等。35、扩增的三个温度：变性94-95℃，退火40-70℃，延伸一般为72℃36PCRPCR（RT-PCR）RNAmRNADNARNAmRNARNAmRNAcDNA，cDNAPCRp6537PCRPCRPCRPCR38、DNAPCRSYBRGreenIDNAPCRSYBRGreenIDNADNA量成正比。荧光信号的检测在每一个循环的延伸期完成后进行。39、荧光共振能量转移技术：包括水解探针、杂交探针和分子信标。水解探针标记原理：反应体系中除有两条引物外还需要一条荧光素标记的探针。探针的5’R，3’QRQ，QRTaqDNATaqDNA5’→3’5’端逐个水解脱氧核苷三磷酸，RQRQ而发射出荧光，仪器的检测系统便可测得荧光信号。RPCRP7440、Ct（阈值循环数）PCR（Ct）Ct（Cp）处相应的反应循环数。CtDNACtCt41、第一代DNA测序技术：Sanger发明的双脱氧链终止法原理：P83-84DNADNA合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的53′-OH3′，5DNA5′→3′延伸。Sanger（ddNTP）作为链终止物。ddNTPdNTP3′位置缺少一个羟基（2′，3′-ddNTP），5′DNA3′-OH，dNTP3′，5′-DNA44dNTP4ddNTPddNTP4ACGT泳，如果测序反应产物被放射标记，那么通过放射自显影胶片上的带型，可直DNA42、第二代测序技术：是基因簇测序技术，其测序平台包括：罗氏/454GSFLKIllumina/SolexaGenomeAnalyzerABISOLiD43、第三代测序技术是单分子测序技术44、生物芯片：是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。DNA45、DNADNA作为探针，有序地、高密度地排列固定于支持物上，然后与标记的样品根据碱基配对的原则进行杂交，通过检测分析杂交信号的强度及分布，对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究。表达谱芯片属于DNA芯片一类。46、蛋白质组（P109）：是指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一个细胞或一个组织或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。蛋白质组学：是指应用各种技术手段研究蛋白质组的一门新兴科学，将借助于高通量双向电泳进行蛋白质的分离，再由专业计算机软件进行图像分析，然后通过质谱技术及蛋白质数据信息处理技术对凝胶上的蛋白质进行分离和鉴定。从而阐明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式，从整体的角度分析，鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平和修饰状态，从而了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系，揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律。蛋白质印迹技术的原理（P109）：WesternNC质的电转移；④靶蛋白的免疫学检测。47白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，具有高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能。原理（P113）：双向电泳（2-PE）SDS-DE凝胶电泳达到分离蛋白质的技术。第一向电泳是依据蛋白质的等电点不同，通pHSDSSDS，即第二次分离。电泳结果形成了分离的蛋白质点，所得蛋白质双向图谱中每个点代表样本中的一CartesinpI48、生物质谱技术分类（P119）：包括电喷雾质谱技术（ESI）、基质辅助激光解析质谱技术(MALDI)、快原子轰击质谱技术和放射性核素质谱。目前在蛋白质组研究中，以ESI质谱仪和MALDI-TOF质谱仪最为常用。7～141答：①收集肿瘤细胞和正常细胞的蛋白质组。②用双向电泳对收集到的蛋白质进行分离③用扫描软件、图像分析等技术对实验结果的图像进行分析，得到有差异的蛋白质位点。④用质谱鉴定差异表达的蛋白。2、开放阅读框概念（ORF）DNA5’端具有翻译的起始密码子3’端具有终止密码子（TGA、TAGTAA）3、间隔序列（RTS）概念答：416SrRNA非结核分枝杆菌。P1695PCRDNA键。6、限制性片段长度多态性分析（RFLP）的概念及原理？P179答：概念答：概念(RFLP)DNADNADNA（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）RFLP原理：该技术是利用限制性内切酶能识别DNADNADNADNADNA序DNA7、用来检测沙眼衣原体的三种基因？P182DNA16SrRNA8、LCR(LCR)是在连接酶扩增反应或连接酶检测反应基础上,引入热稳定的连接酶而建立的新技术。LCRDNA特点是特异性强,灵敏度高。9、支原体是一类目前所知能独立生活、自行繁殖的最小原核细胞微生物。10DNAmRNAcDNA11、镰状细胞贫血形成的分子机制？如何用分子生物学方法来检测？答：镰状细胞贫血是由于β珠蛋白基因中最常见的错义突变引起的溶血性贫血，属于隐性常染色体遗传病。镰状细胞贫血患者由于β6GAGGTG，结果使β珠蛋白链6为镰状血红蛋白（HbS）。因亲水侧链被非极性的疏水侧链所取代，在βVal6βValHbS1进行线性缔合，导致氧结合能力过低，红细胞发生镰变，弹性几乎丧失，无法变形，不能通过直径比红细胞小的毛细血管，引起微循环阻塞，心、肺、肾脏严重损伤。检测：镰状细胞贫血常用的分子生物学检验方法主要有限制性酶谱分析、ASO探针杂交、AS-PCR等，最常用的是限制性酶谱分析。12、如果突变发生在β珠蛋白基因的启动子区域，导致转录的βmRNA水平下降；如果突变发生在剪接信号或其周围的通用序列，或隐性剪接信号因突变被激活，引起异常剪接，产生的异常βmRNA通常是不稳定的，易被破坏，失去合成β珠蛋白的功能；如果在β珠蛋白基因ORF中发生核苷酸的取代、缺失、插入，引起错义突变、移码突变或无义突变等，则导致β珠蛋白链的合成量减少、根本没有或产生异常的β珠蛋白链。13、原癌基因：是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。癌基因：原癌基因发生某些错误或功能丧失时，极易导致原癌基因转变为可使正常细胞转化为肿瘤的转化基因或癌基因。抑癌基因：又称肿瘤抑制基因，为一类可编码对肿瘤形成起阻抑作用蛋白质的基因，正常情况下负责控制细胞的生长和繁殖。14、原癌基因的激活机制包括：①插入激活；②基因重排/染色体易位；③基因点突变/移码突变；④基因扩增；⑤基因转录改变。15、原癌基因的种类：包括生长因子、生长因子受体、信号转导蛋白、核调节蛋白、细胞周期调节蛋白和抑制凋亡蛋白。16、原癌基因与抑癌基因的区别：①在功能上，抑癌基因起负调控作用，而原癌基因起正调控作用；②在遗传方式上，原癌基因是显性的，而抑癌基因在细胞水平上是隐形的；③在突变发生的细胞类型上，抑癌基因突变可以发生在体细胞中，也可能发生在生殖细胞中并通过生殖细胞得到遗传。原癌基因突变只发生在体细胞中。17、肿瘤分子表观遗传学异常的分子机制。P217异常的分子机制有：①印记丢失；②DNACpG5-甲基胞嘧啶；③组蛋白修饰与染色质重塑。18、线粒体的主要功能是氧化产能，因此被称为“细胞的能量工厂”。DNA16569bp（H）和轻链（L）3713的结构基因、22tRNA2rRNAP23319、线粒体基因表达系统。P234①密码子：与核基因密码子存在一些差异。DNAmtDNADNA20、DNA突变率极高的原因。P234DNAmtDNA的重要功能；②线粒体DNA缺少组蛋白的保护；③线粒体DNA容易被呼吸链生成自由基氧化损伤；④线粒体中没有DNA损伤的修复系统；⑤线粒体DNA复制频率高，H链长期单链裸露，可自发脱氧基导致突变。21、mtDNAmtDNAmtDNA变异。P23