细菌-细菌检查技术（动物微生物）

细菌标本片的制备及革兰氏染色革兰氏染色法由丹麦病理学家ChristainGram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应。弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。一、实验目的1、掌握细菌抹片的制备方法。2、掌握革兰氏染色技术。2、了解革兰氏染色原理。二、实验材料菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌革兰氏染色液：草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红染色液载玻片、染色缸、吸水滤纸、显微镜、香柏油、镜头擦洗液、擦镜纸等1.细菌标本片制备：包括涂片、自然干燥、固定三步。（1）涂片：点燃酒精灯，用镊子将浸泡在酒精中的载玻片取出，滤掉多余的酒精，在酒精灯上将剩余的酒精烧完，待载玻片完全干燥后，将载玻片置于载玻片支架上。用滴管滴一小滴生理盐水于载玻片中央，注意生理盐水不宜过多。取接种环在火焰上灼烧灭菌，待冷却后，从培养皿内钓取少许菌落，置于载玻片上的生理盐水中涂抹混匀，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。注意接种环取菌时不宜过多；涂片必须均匀，不可过于浓厚。三、实验操作步骤水滴菌体涂片载玻片使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜（2）干燥：将涂片置于室温下自然干燥；若天气较冷时，可将标本面朝上，在离酒精灯火焰较远处（温度以不烫手为宜）烘干。注意：切勿紧靠火焰，温度过高会改变甚至破坏细菌细胞形态。（3）火焰固定将已干燥的抹片涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰2-3次。待涂片冷却后进行染色。细菌抹片火焰固定目的：杀死细菌，染料能着色；细胞壁通透性增加，便于着色；菌附着于玻片，不被洗掉。

火焰固定

干燥2.革兰氏染色程序：初染：将已干燥、固定好的抹片置于载玻片支架上，滴加2-3滴草酸铵结晶紫染色液于菌膜上（滴加染液的量以覆盖菌膜部位为宜），染色1-2min。水洗：倾去染液，自来水冲洗。注意水流不宜过急、过大，不要直接冲在菌膜处。至洗出水无色为止。媒染：滴加2-3滴碘液覆盖菌膜，染色1min。水洗：水洗方法同上。脱色：滴加2-3滴95%乙醇溶液，脱色30s后立即水洗，以终止脱色。水洗复染：滴加2-3滴石碳酸复红染液，染色1-2min。水洗结晶紫初染碘液媒染95%乙醇脱色复红复染干燥、固定好的抹片革兰氏染色程序

水洗水洗水洗3、油镜观察将染色后的细菌抹片用吸水纸吸去过多水分，自然干燥或电吹风吹干，用显微镜油镜观察菌片：在标本片菌膜处滴一滴香柏油；将标本片置于载物台上；低倍镜聚焦使图像清晰；中倍镜聚焦使图像清晰；直接由中倍镜镜头转到低倍镜镜头，再转到油镜镜头；用细准焦螺旋微调使图像清晰；观察菌体颜色、大小，形态。油镜下可见：葡萄球菌菌体呈蓝紫色，葡萄状排列，为革兰氏阳性菌（G+）；大肠杆菌菌体呈红色，单个散在，为革兰阴性菌（G-）。四、结果葡萄球菌大肠杆菌五、革兰氏染色注意事项选用培养18--24h菌龄的细菌为宜。革兰氏染色注意载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要均匀、薄，不宜过厚。火焰固定时不宜过热，否则会改变甚至破坏细胞形态。水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水流从载玻片的一端流下；冲洗时水流不宜过急、过大，以免涂片薄层脱落。酒精脱色是染色成败的关键，酒精脱色不宜过度。用水流冲洗时，不要直接对着涂片区冲洗。革兰氏染色结果是否正确，95%乙醇脱色是关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌会被误染为阴性菌。六、革兰氏染色原理革兰氏阳性菌（G+菌）通过结晶紫初染和碘液媒染后，在G+菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物；由于G+菌细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，当用95%乙醇溶液作脱色处理时，G+菌细胞壁因失水反而使细胞壁网孔缩小，再加上G+菌细胞壁不含类脂，故乙醇处理时G+菌细胞壁不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在G+菌细胞壁内，使其仍呈紫色。革兰氏阴性菌（G-菌）因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，用95%乙醇溶液脱色液时，以类脂为主的外膜迅速