形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析

形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析【摘要】目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶的编码基因。方法:采用聚合酶链反应扩增弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-TEasy载体，转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定，并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列，测序结果表明，获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1812bp，编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因，为其相关研究奠定了基础。

【关键词】弓形虫核苷水解酶克隆序列分析

Abstract:Objective:Tocloneandanalyzethenucleosidetriphosphatehydrolase(NTPase)geneofToxoplasmagondii.Methods:TheNTPasegenewasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)fromRHstrainofToxoplasmagondiiandclonedintopGEM-TEasyvector.PositivecloneswerescreenedandidentifiedbyBglⅡ、HindⅢdigestionandsequenced.TheDNAsequenceanditsdeducedproteinsequencewereanalyzed.Results:TheNTPasegenewasspecificallyamplified,DNAsequenceanalysisshowedthatthelengthofclonedgenewas1812basepair.Thehomologyofthisdeducedaminoacidssequencewas100%tothatintheGenebank.Conclusion:TheNTPase-Ⅱgeneissuccessfullycloned,providingbasisforthefutureresearchaboutthisgene.

Keywords:Toxoplasmagondii;NTPase;cloning;sequencing

刚地弓形虫是专性细胞内寄生的机会致病性原虫，呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶为分布于弓形虫速殖子表面一种主要特异性抗原[1，2]，其对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用。目前，国内关于弓形虫病诊断和疫苗候选抗原的研究主要集中在P30和P22抗原[4-6]，而对NTPase的研究鲜见报道。因此，我们对弓形虫RH株的NTPase基因进行扩增与克隆，为下一步的研究奠定基础。

1材料和方法

虫株和试剂弓形虫RH株由浙江省医学科学研究院寄生虫病研究所惠赠；DH5α为本室保存；pGEM-TEasy载体购自Promega公司。淋巴细胞分离液购自Sigma公司；限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ和基因组DNA提取试剂盒均为大连宝生物产品；2×PCRMasterMix试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司；小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技术公司；200bpMarker及DNA凝胶回收试剂盒为上海生物工程技术有限公司产品。

模板DNA制备弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代，感染3d后无菌操作抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液，800r/min离心8min后加速至2000r/min离心10min，收集中层虫体，按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。

PCR扩增根据弓形虫NTPase参考核苷酸序列和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，采用PrimerDesigner引物设计软件自行设计引物，由上海基康生物技术公司合成，引物序列上游引物：5‘-GAAGATCTACAGACTCATCGTCACTCCG-3‘，下游引物：5‘-GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC-3‘。采用2×PCRMasterMix试剂盒扩增NTPase基因，PCR反应总体积为50μl：其中含有模板DNA5μl，上下游引物各1μl。同时设立空白对照。PCR反应参数：95℃5min×1；95℃45s，58℃45s，72℃60s×30；72℃10min×1。%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收。

T-A克隆及测序回收的PCR产物与pGEM-TEasy载体16℃过夜连接。连接体系为10μl：纯化的PCR产物3μl，2×buffer5μl，pGEM-TEasyVector1μl，T4DNA连接酶1μl。连接产物转化感受态DH5α，吸取200μl转化后的感受态细菌涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，筛选阳性克隆。阳性重组子经培养和提取质粒后，分别进行BglⅡ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定，并送上海基康生物技术公司测序。测序结果采用DNAMAN软件与Genebank公布的弓形虫NTPase基因序列进行比较，并推导其编码的氨基酸序列。对获得的基因及其氨基酸序列的同源性、保守功能域、二级结构等进行生物信息学分析。

2结果

PCR扩增结果从弓形虫RH株DNA模板中扩增获得预期大小的目的条带。

序列测定及推导的氨基酸序列的生物信息学分析

物理化学性质预测：测定的弓形虫NTPase编码区基因长1812bp，A+T含量为%，G+C含量为%，预测编码603个氨基酸，理论等电点为，Mr为66900，其中含80个碱性氨基酸，78个酸性氨基酸，275个非极性疏水性氨基酸，170个极性氨基酸。获得的NTPase编码基因及推导的氨基酸序列见图2。

同源性分析：用NCBI的BLASTN程序对弓形虫NTPase编码基因序列进行核苷酸的同源性分析，结果显示获得的基因序列与GenBank上提交的NTPase-Ⅱ基因同源性达100%。

抗原表位预测：用DNAStar软件对弓形虫NTPase-Ⅱ可能的抗原表位进行预测，NTPase-Ⅱ氨基酸序列中存在6个潜在的抗原表位。

保守功能域分析：用Expasy的ScanProsite程序分析推导的弓形虫NTPase-Ⅱ氨基酸序列的保守功能域，发现在206～221位氨基酸具有GDA1/CD39家族的核苷磷酸酶标志。氨基酸序列中还存在cAMP、cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点(aa82～85)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(aa207～210、317～320、341～344、354～357、409～412、422～425、444～447、465～468、475～478、593～596)、N末端十四酰化位点(aa47～52、208～213、239～244、254～259、303～308、324～329)、蛋白激酶C磷酸化位点(aa5～7、13～15、26～28、50～52、74～76、223～225、273～275、379～381、465～467、475～477)、酰胺化位点、N末端糖基化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点。

二级结构预测：用Expasy的predictprotein预测，弓形虫NTPase-Ⅱ的氨基酸二级结构α螺旋与β片层和卷曲环之比为∶∶，属于混合型，核心氨基酸与暴露残基之比为∶，卷曲环区与平均柔曲性高峰区基本一致。

3讨论

弓形虫NTPase是弓形虫在宿主细胞内环境下获得嘌呤的寄生机制而产生的，对弓形虫的寄生和繁殖都具有重要的作用。体外研究发现，弓形虫产生的NTPase在二巯基化合物的激活作用下，能连续水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷至单磷酸形式。感染宿主细胞的弓形虫速殖子即是利用NTPase分解宿主细胞来源的ATP，以合成维持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。

NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ两种亚型，组成两亚型的628个氨基酸中只有16个残基不一样，两亚型的编码基因有31个碱基不同且均不含有内含子。NakajimaK等曾报道，使用NTPase-ELISA试验血清学诊断急性弓形虫病与Sabin-Feldman标准染色试验具有很好的相关性，且NTPase两亚型间的抗原性并无明显区别。Kikuchi等制备的特异性抗NTPase单克隆抗体6C6可与弓形虫强毒力株和非毒力株的4种不同的NTPase异构酶分子均发生反应，即6C6可识别4种NTPase异构酶的共同表位[10]。NTPase-Ⅱ亚型存在于弓形虫的所有虫株中，且具有强抗原性和较好的免疫反应性。本实验成功克隆出NTPase-Ⅱ基因，其测序结果与Genbank登陆序列L39079比较，核苷酸序列同源性高达100%，说明NTPase-Ⅱ为高度保守基因。本实验预测得NTPase-Ⅱ蛋白具有6个潜在的抗原表位，为我们今后表达重组NTPase蛋白用于弓形虫感染的免疫诊断和疫苗候选抗原的筛选奠定了基础。

【参考文献】

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