DB35T 1748-2018大灰蛞蝓检疫鉴定方法

ICS07.080B16DB35方标准DB35/T1748—2018大灰蛞蝓检疫鉴定方法DetectionandidentificationofLimaxmaximusLinnaeus2018-04-03发布 2018-07-03实施福建省质量技术监督局发布IIDB35/T1748—2018目次TOC\o"1-5"\h\z前言 II1范围 12规范性引用文件 1术语与定义 1大灰蛞蝓基本信息 15鉴定依据 26器具与试剂 27现场检疫 2实验室鉴定 2结果评定 310标本处理和保存 3附录A（资料性附录）大灰蛞蝓寄主、地理分布及危害性 5附录B（规范性附录） 大灰蜻蝙实时荧光PCR检测 6附录C（资料性附录） 大灰蜻蝙形态特征 7DB35/T1748DB35/T1748—2018本标准按照GB/T1.1-2009给岀的规则起草。本标准由福建岀入境检验检疫局提岀并归口。本标准起草单位：福建岀入境检验检疫局、福建农林大学。本标准主要起草人：王沛、周卫川、陈泰林、王宇、林阳武、丁红丽、林俊宏。DB35/T1748DB35/T1748—201811大灰蛞蝓检疫鉴定方法1范围本标准规定了大灰^蝓(LimaxmaximusLinnaeus,1758)的检疫鉴定方法。本标准适用于进岀境运输工具、原木、木质包装材料、种苗、花卉、水果、蔬菜等携带大灰蛞蝓的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T3067-2011软体动物常规检疫规范3术语和定义SN/T3067-2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1生殖器genitaIia蜻蝙为雌雄同体、异体交配的动物，雄性生殖系统主要包括输精管、阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌等部分，雌性生殖系统主要包括受精囊、受精囊柄等部分。生殖系统的特征在种、属、科級阶元都较为稳定，是分类的重要依据。3.2阴茎penis阴茎系统一般由阴茎、阴茎本体、阴茎牵引肌和鞭状体组成，其中后三者常因种类不同而缺失。大灰蜻蝙无鞭状体。3.3受精囊bursacopuIatrix蜻蝙的受精器官，由受精囊和受精囊柄组成，其中受精囊柄的形态和有无分支常用于分类鉴定。3.4软体softbody蜻蝙的身体，其内有退化的贝壳即盾板。软体的颜色和长度可用于分类。4大灰蜻揄基本信息以下列岀大灰蜻蝙的基本信息，其他信息参见附录A。中文名：大灰蜻蝙；豹纹蜻蝙。英文名:greatgreyslug;leopardslug。学名:LimaxmaximusLinnaeus,1758。DB35/T1748—2018DB35/T1748—2018异名：LimaxcinereusLister,1678；LimaxcinereusMuller,1774；LimacellaparmaBrard,1815；LimaxmaculatusNunneley,1837；LimaxcellariusLessonaetPolonera,1882；LimaxcarbonariusalbanicusJaeckel,1954。分类地位：软体动物门Mollusca,腹足纲Gastropoda,柄眼目Stylommatophora,蛞蝓科Limacidae,利迈科斯属Limax。5鉴定依据传播方式和传播途径是确定现场检疫的依据。软体、生殖系统形态特征和分子生物学特性是实验室鉴定的依据。6器具与试剂6.1仪器和用具仪器：体视显微镜、微型离心机、恒温金属浴、荧光PCR仪、低温冰箱。用具：放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4皿孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、白瓷盘、培养皿、镊子、剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针、解剖腊盘、标签、移液枪、1.5mL离心管、八连排荧光PCR反应管。6.2试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA提取试剂盒、实时荧光PCR检测试剂（见附录B）、ddH=0o7现场检疫1对来自疫区（参见附录A）的集装箱、木质包装材料必须重点检查，仔细观察集装箱的底部和四角部位以及所装货物与棊质包装材料是否有蜻蝙。注意阴暗蔽光处的检查，用手电筒仔细寻找蜻蝙的行迹。对来自疫区的原木、盆景、苗木、水果等未经加工的植物性原材料也应认真检查，对可能被蜻蝙污染的物品可用高压水枪冲洗后再检查。■,7.2蜻蝙爬行过后，都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹，这是判定是否有蜻蝙污染的重要依据。发现蜻蝙标本，装入塑料自封袋或标本瓶带回实验室做进一步的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其它细碎衬垫材料时，需过筛检查是否有卵或幼体。8实验室鉴定1测量、观察、解剖和饲养1.1用游标卡尺测量蜻蝙软体的长度。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和蜻端的形态特征。8.1.2将闷杀处理（见10.1）后的标本，按照SN/T3067-2011中8.3.1进行软体解剖，分离岀生殖系统。8.1.3单独查获的卵粒，按照SN/T3067-2011中8.4方法，将其孵化和饲养为成年蜻蝙后，再做鉴定。2DB35/T1748DB35/T1748—2018#附录B（规范性附录）

大灰蛞揄实时荧光PCR检测B.1DNA提取取腹足肌肉约30mg,用SDS方法或动物基因组DNA试剂盒方法提取DNA。B.2引物及探针LMF：5,-CCTGGAGGTGCCATGGGTTT-3,LMR：5,-ACGACGGGCTCGATGTGAAA-3,LMP：5,-FAM-ACGACGGGCTCGATGTGAAA-BHQ-3,B.3反应体系反应体系为25卩L：其中DNA模板2卩L（100ng/卩L）,LMF（10飾）1卩L,LMR（10飾）1卩L,LMP（10 卩M） 1 卩L, 2XPremixExTaq12.5 卩L, RoxII0.5 卩L , ddH?。7ML。B.4反应程序95°C5min；95°C10s、60°C40s,共40个循环。B.5阳性对照，阴性对照和空白对照的设置阳性对照：大灰蜻蝙,阴性对照:非大灰蜻蝙，空白对照：ddH=O„B.6结果判定在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值小于或等于21并岀现典型扩增曲线的条件下：待测样品的Ct值大于或等于40时，判定非大灰蜻蝙；待测样品的Ct值小于或等于35时，判定大灰蜻蝙；待测样品的Ct值大于35且小于40时，应重新进行测试；如果重新测试的Ct值大于或等于40时，判定非大灰蜻蝙；如果重新测试的Ct值大于35且小于40时，贝倒岫灰蜻蝙。DB35/T1748DB35/T1748—201888DB35/T1748DB35/T1748—201877附录C（资料性附录）

大灰蛞揄形态特征图C.1所示为大灰蛞蝓的卵形态特征。图C.1卵形态特征图C.2所示为大灰蜻蝙的软体形态特征。图C.2软体形态特征

图C.3所示为大灰蛞蝓的生殖系统形态特征。说明：BC——受精囊；PBC 受精囊柄；VD——输精管