基因工程和蛋白质工程公开课

基因工程和蛋白质工程公开课第一页，共五十八页，编辑于2023年，星期五

基因工程又叫做

或

。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种

提取出来，加以

，然后放到另一种生物的细胞里，

改造生物的遗传性状。基因拼接技术DNA重组技术基因修饰改造定向地一、基因工程的概念第二页，共五十八页，编辑于2023年，星期五操作对象：操作环境：原理：操作水平：目的：体外基因重组DNA分子水平基因定向地改造生物的遗传特性一、基因工程的概念第三页，共五十八页，编辑于2023年，星期五为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上？为什么能把一种生物的基因可以在另一种生物体内表达？不同生物的DNA都具有规则的双螺旋结构和4种脱氧核苷酸组成不同的生物共用一套遗传密码思考第四页，共五十八页，编辑于2023年，星期五(1)来源：(2)特点：一种限切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点准确切割DNA主要来自原核生物二、基因工程的基本工具1.基因工程的——限制性内切酶

限制酶具有专一性第五页，共五十八页，编辑于2023年，星期五

EcoRⅠ黏性末端黏性末端限制性内切酶的作用过程第六页，共五十八页，编辑于2023年，星期五SmaⅠ平末端平末端第七页，共五十八页，编辑于2023年，星期五G1234512345A第八页，共五十八页，编辑于2023年，星期五(1)来源：(2)特点：一种限切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点准确切割DNA

(3)作用部位

磷酸二酯键主要来自原核生物二、基因工程的基本工具1.基因工程的——限制性内切酶第九页，共五十八页，编辑于2023年，星期五要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。用同种限制酶切割来源不同的DNA获得的黏性末端是否相同？

相同思考不同的限制酶呢？

不同第十页，共五十八页，编辑于2023年，星期五……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切第十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期五（1）作用:催化磷酸二酯键形成，连接DNA片段二、基因工程的基本工具2.基因工程的——DNA连接酶第十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期五

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键第十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期五（2）类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（1）作用:催化磷酸二酯键形成，连接DNA片段二、基因工程的工具2.基因工程的——DNA连接酶第十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期五寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?GCTTAAGCTTAA第十五页，共五十八页，编辑于2023年，星期五（1）运载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等二、基因工程的工具3.基因工程的——运载体质粒：细菌细胞中一种很小的环状DNA分子。裸露的、结构简单、独立于细菌之外，并且有自我复制能力

（１）质粒上会存在某些标记基因，标记基因有什么用途？（２）要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性内切酶和几种DNA连接酶处理？第十六页，共五十八页，编辑于2023年，星期五二、基因工程的工具3.基因工程的——运载体（2）条件：①能自我复制并在受体细胞中稳定存在②具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接③具有标记基因，便于进行筛选④结构简单，大小适中第十七页，共五十八页，编辑于2023年，星期五小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键

种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具标记基因质粒、λ噬菌体衍生物

、动植物病毒第十八页，共五十八页，编辑于2023年，星期五1.科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是A.定向提取生物体的DNA分子B.定向地对DNA分子进行人工“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向地改造生物的遗传性状D练习第十九页，共五十八页，编辑于2023年，星期五2.下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是A.一种限制酶只能识别一种特定的脱氧苷酸序列B.限制酶的活性受温度的影响C.限制酶能识别和切割RNAD.限制酶可从原核生物中提取练习C第二十页，共五十八页，编辑于2023年，星期五2.下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是A.一种限制酶只能识别一种特定的脱氧苷酸序列B.限制酶的活性受温度的影响C.限制酶能识别和切割RNAD.限制酶可从原核生物中提取练习C第二十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期五3.关于限制酶说法中，正确的是（）A．限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B．EcoRI切割的是G—A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中练习C第二十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期五4.以下说法正确的是（）A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B.质粒是基因工程中唯一的运载体C.运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D.DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键C练习第二十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期五1.基因工程的操作工具：限制性内切酶、DNA连接酶2.基因工程的工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、载体复习旧知3.限制性内切酶的化学本质是

；DNA连接酶的化学本质是

；载体的化学本质是

。蛋白质蛋白质DNA4.限制性内切酶的作用部位是

；DNA连接酶的作用部位

。磷酸二酯键磷酸二酯键第二十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期五复习旧知5.限制性内切酶的特点：一种限制性内切酶只能识别一种特定的

序列，并于

上准确地切割双链DNA分子。脱氧核糖核苷酸特定位点6.载体必需具备的特点1.结构简单,大小适中2.能在宿主细胞中

并稳定存在3.具一个或多个

。4.具

基因自我复制限制酶切位点标记第二十五页，共五十八页，编辑于2023年，星期五1.目的基因的获取基因工程的一般程序2.基因表达载体的构建3.目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定第二十六页，共五十八页，编辑于2023年，星期五（一）目的基因的获取三、基因工程的基本操作程序1.目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2.获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因（2）利用PCR技术扩增目的基因（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成第二十七页，共五十八页，编辑于2023年，星期五（1）从基因文库中获取目的基因①基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库

基因组文库部分基因文库（cDNA文库）第二十八页，共五十八页，编辑于2023年，星期五②基因文库的构建方法（1）从基因文库中获取目的基因a.直接分离—“鸟枪法”（原核细胞）优点：操作简便缺点：工作量大，具一定盲目性b.人工合成—反转录（真核细胞）取出DNA用限制酶切断DNA第二十九页，共五十八页，编辑于2023年，星期五通过对受体菌的培养而储存基因③基因文库的储存（1）从基因文库中获取目的基因第三十页，共五十八页，编辑于2023年，星期五（2）利用PCR技术扩增目的基因①PCR全称为多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。第三十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期五③条件：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________DNA复制脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶模板DNA（2）利用PCR技术扩增目的基因①PCR全称为多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。④过程：第三十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期五模板DNA95℃第三十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物第三十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第三十五页，共五十八页，编辑于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始第三十六页，共五十八页，编辑于2023年，星期五④过程：a.DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b.退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第三十七页，共五十八页，编辑于2023年，星期五蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（3）化学方法人工合成目的基因DNA合成仪第三十八页，共五十八页，编辑于2023年，星期五从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成（一）目的基因的获取三、基因工程的基本操作程序第三十九页，共五十八页，编辑于2023年，星期五用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。用_____________切断目的基因，使其产生_________________。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端DNA连接酶（二）基因表达载体的构建（核心步骤）三、基因工程的基本步骤第四十页，共五十八页，编辑于2023年，星期五重组载体组成：三、基因工程的基本步骤a.目的基因b.启动子c.终止子d.标记基因（二）基因表达载体的构建（核心步骤）第四十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期五将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增（三）将目的基因导入受体细胞三、基因工程的基本步骤1.植物细胞：2.动物细胞：3.微生物细胞：（受精卵、卵细胞、体细胞）（受精卵或早期胚胎干细胞）农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射法感受态细胞法第四十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期五1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法（双子叶植物和裸子植物）Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌第四十三页，共五十八页，编辑于2023年，星期五2.将目的基因导入动物细胞

方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？第四十四页，共五十八页，编辑于2023年，星期五微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性第四十五页，共五十八页，编辑于2023年，星期五受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞（三）将目的基因导入受体细胞三、基因工程的基本步骤第四十六页，共五十八页，编辑于2023年，星期五1.检测（四）目的基因的检测与鉴定三、基因工程的基本步骤①导入检测：检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因DNA分子杂交法（或核酸探针法）第四十七页，共五十八页，编辑于2023年，星期五②转录检测：检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交法（核酸探针法）③翻译检测：检测目的基因是否翻译成蛋白质免疫法，提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交1.检测（四）目的基因的检测与鉴定三、基因工程的基本步骤①导入检测：检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因DNA分子杂交法（或核酸探针法）第四十八页，共五十八页，编辑于2023年，星期五1.检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译2.鉴定:个体生物学水平鉴定（四）目的基因的检测与鉴定三、基因工程的基本步骤第四十九页，共五十八页，编辑于2023年，星期五第五十页，共五十八页，编辑于2023年，星期五归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定从基因文库利用PCR化学方法人工合成目的基因、启动子、终止子、标记基因载体转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）第五十一页，共五十八页，编辑于2023年，星期五第二节基因工程的应用第五十二页，共五十八页，编辑于2023年，星期五一、基因工程在农业上的应用①抗虫棉②金米第五十三页，共五十八页，编辑于2023年，星