X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构课件

蛋白质结构测定2011-3-30蛋白质三维结构测定方法及数量蛋白质三维结构测定年增长图第一节：X-射线衍射技术用于蛋白质晶体结构测定原理n基本过程n优缺点n应用实例n一、相关原理光的衍射现象nnX射线的发现及应用本质的争论nnX射线衍射的发现晶体学基础知识X射线晶体衍射nn1.光的衍射现象‘光线’拐弯了！?当缝的大小（或障碍物的大小）跟波长相差不多时就发生明显的衍射现象．如果缝很宽，其宽度远大于波长，则波通过缝后基本上是沿直线传播的，衍射现象就很不明显了．惠更斯—菲涅耳原理惠更斯：光波阵面上每一点都可以看作新的子波源，以后任意时刻，这些子波的包迹就是该时刻的波阵面。——1690年解释不了光强分布！菲涅耳补充：从同一波阵面上各点发出的子波是相干波。——1818年2.X射线的发现历程及应用失之交臂n1836法拉第

发现阴极射线qq1861克鲁克斯

阴极射线管在放电时会产生亮光

干版和光片有问题？1890古德斯柏德

洗出了一张X射线的透视底片

照片的冲洗药水或冲洗技术q发现X射线本质的争论X射线衍射nnn2.X射线的发现及应用1895年

伦琴（Roentgen）发现故称为伦琴射线。n伦琴夫人的手的X射线照片X射线在医学上的应用伦琴的新发现轰动了全世界,不到三个月,维也纳的一n家医院便拍出了应用于医疗的X射线照片.从此,X射线拍片和射线透视成为医学诊疗中常用的手段。为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便,科n学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器。1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像重建理论,制成了电子计算机射线断层扫描成像装置,也就是已被广泛应用的CT。X射线与诺贝尔奖—物理学奖n

伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。n

1903年诺贝尔物理学奖。n

1906年的诺贝尔物理学奖。n

劳厄获得了1914年诺贝尔物理学奖。n

英国的布拉格父子1915年的诺贝尔物理学奖。n

英国的巴克拉1917年的诺贝尔物理学奖。n

瑞典物理学家西格班1924年诺贝尔物理学奖。n

美国的康普顿1927年诺贝尔物理学奖。n

前苏联的切连科夫1958年诺贝尔物理学奖;n

美国的霍夫斯塔特1961年诺贝尔物理学奖;n

瑞典的西格巴恩1981年的诺贝尔物理学奖。化学奖荷兰的物理化学家德拜1936年诺贝尔化学奖。n美国著名化学家鲍林1954年诺贝尔化学奖。n英国生物学家肯德鲁与佩鲁茨1962年诺贝尔化学奖。n英国女化学家霍奇金1964年诺贝尔化学奖。n美国化学家利普斯科姆1976年诺贝尔化学奖。n英国化学家桑格和美国化学家吉尔伯特1980年诺贝尔化学奖。n英国生物化学家克卢格因1982年诺贝尔化学奖;n美国化学家豪普特曼和卡尔1985年诺贝尔化学奖;n1988年,米歇尔等三位德国生物化学家诺贝尔化学奖。n3.X射线本质的争论X射线本质的争论--波动说巴克拉：

X射线波动性标识谱线：不管元素已化合成什么化合物，它们总是发射一种硬度的X射线，当原子量增大时，标识X射线的穿透本领会随着增大。这说明X射线具有标识特定元素的特性。X射线本质的争论—微粒说布拉克父子X射线微粒论者粒子具有旋转性4.X射线衍射X射线衍射的获得波长范围：10—0.1埃n欲观察其衍射现象则衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格常n数恰是这样的线度衍射波的两个基本特征—衍射线（束）在空间分布的方位（衍射n方向）和强度与晶体内原子分布规律（晶体结构）密切相关。X射线晶体结构分析？nü

使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现象为物理原理，以晶体作为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种分析方法。5.X射线的获得：X射线管激光等离子体X射线激光同步辐射6.晶体基础什么是晶体n晶体的周期排布n晶体的对称性n3.1什么是晶体固体物质n晶体q相当罕见的东西？n非晶体q晶体(Crystal

)n指离子、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性重复ü排列形成的、能够给出明锐衍射的固体结构。晶体什么样（1）晶体什么样（2）晶体什么样（3）晶体什么样（4）2.晶体和点阵结构晶体的周期性结构使得我们可以把它抽象成“n点阵”来研究.一维周期性结构与直线点阵q二维周期性结构与平面点阵q三维周期性结构与空间点阵q一维周期性结构与直线点阵二维周期性结构与平面点阵三维周期性结构与空间点阵晶胞(Unit

cell)n空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。ü同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。ü选择平行六面体的原则：n①所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。q②

选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体q③

所选平行六面体之体积应最小。q④

当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距q小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行六面体。单位平行六面体，a、b、c、、、

是表征它本身形状、大小的一组参数，称为格子参数或点阵参数。cba单位平行六面体参数单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角＝坐标轴之间交角。a、b、c＝轴单位。a、b、c、、、

关系有七种情况，与单位平行六面体七种格子相对应。立方格子a=b=c==

=90o三方格子a=b=c==

≠90

，o60，109

28'16"o菱面体格子中α为特殊角度时，演变成的三种立方体格子四方格子a=b≠

c

==

=90o六方格子ooa=b≠c

==90

=120正交格子a≠

b≠

c

==

=90o单斜格子ooa≠

b≠

c

=

=90

≠90三斜格子a≠b

≠c

≠

≠

≠

90o按结点位置，可有四种不同的类型：P——原始格子（角顶）C——底心格子（角顶、顶底面）I——体心格子（角顶、体心）F——面心格子（角顶、每个面）P——

原始格子（角顶）C——底心格子（角顶、顶底面）I——体心格子（角顶、体心）F——面心格子（角顶、每个面）结构中代表各类等同点的结点在空间的排列方式来说，格子的种类有、且只有十四种。衍射方向二、X射线晶体结构测定基本过程①蛋白质获取（提纯）②晶体生长并经冷冻技术处理③重原子衍生物制备④衍射数据收集⑤衍生数据分析和改进⑥结构模型的获取（包括修正）（2）晶体生长过程及影响因素晶核（尽量少）n微晶（可用作晶种）n晶体在数小时至数月后出现n2个问题：n是盐晶吗？①能给出有用的衍射吗？（多晶/双晶）②（2）晶体生长过程及影响因素影响因素n物理因素：温度、压力、震动、溶剂清洁度、试剂v纯度、重力、外加物理场等生物化学因素：pH、离子强度、沉淀剂/添加剂的v类型和浓度等其他：溶液过饱和度、纯度等v“经验”

“机器人”（3）结晶方法批量结晶法

batchcrystallizationn透射法

crystallizationbydialysis液相扩散法

liquiddiffusion气相扩散法vapordiffusion氢氘交换质谱技术nnnnEnhancedamidehydrogen/deuterium-exchangemassspectrometry,DXMS生物玻璃bioglassn（4）晶体的初步鉴定小分子晶体蛋白质晶体边界完整，漂亮常不完整，易出现多晶硬度偏硬，易碎成2瓣或几瓣偏软，易碎成粉脱水不变化慢因脱水而变坏溶解性偏光性染色性漂浮性快强相对弱强弱下沉漂浮（5）衍射数据收集晶体的处理：低温液氮气冷流技术n数据收集仪：底片、面探测器n衍射分析仪器的发展n

射线种类：连续射线

特征射线

电子衍射

中子衍射•

探测技术：胶片

闪烁体计数器（点）

（IP）CCD探测器（面）图2-22

石英的衍射仪计数器记录图（部分）*右上角为石英的德拜图，衍射峰上方为（hkl）值，β代表Kβ衍射底片（外森堡相机、徘循相机）优点：n多点同时收集ü容易保存ü价格便宜ü缺点q存在“化学雾”背景和X射线散射背景o费时、费力o计数管（四圆衍射仪）将X射线光子强度转换为电信号，信号放大后n再转换成数字存入计算机随时调用逐点收集数据n优缺点与底片相反n面探技术-SMARTAPEX-CCD衍射仪SmartCCDOverviewSMARTAPEX-CCD探测器面探技术-SMARTAPEX-CCD衍射仪金属丝构成的面板，可同时多点收集n将X射线光子强度转换为电信号n集计数管的精确和底片的多点收集效率n图像板imageplate面探测器的改进n由化学材料构成，整块板子密度一致n高分辨率n可见光下可测量n集底片和面探测器的优点于一身n（6）数据分析电子密度修饰n电子密度图诠释n结构模型精化n数据处理软件：Denzo,Scalepack三、X射线晶体结构测定优点分辨率高n不损伤样品n无污染n相对快捷n能得到晶体完整性的大量信息n四、X射线晶体结构测定存在问题晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态n的构象；很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）nnX射线晶体衍射的工作流程较长。Last

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2009

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PDT五、应用实例1.胰岛素于1971年和1972年分别得