离子交换和体积排除色谱演示文稿

离子交换和体积排除色谱演示文稿目前一页\总数四十四页\编于五点（优选）离子交换和体积排除色谱目前二页\总数四十四页\编于五点离子交换色谱的机制目前三页\总数四十四页\编于五点离子交换平衡目前四页\总数四十四页\编于五点离子交换的类型强弱强交换剂在pH2至12的范围内保持离子状态弱交换剂在pH改变时可能会变为非离子化状态目前五页\总数四十四页\编于五点硅胶型的离子交换剂优点 高柱效小颗粒没有收缩或膨胀机械稳定性好能耐受有机溶剂价格低缺点2<pH<7低容量（meg/g）目前六页\总数四十四页\编于五点聚合物基础上的离子交换聚苯乙烯－二乙烯基苯的合成（PSDVB）其他聚合物基础上的离子交换例,甲基丙烯酸酯目前七页\总数四十四页\编于五点离子交换树脂的合成目前八页\总数四十四页\编于五点聚合物基质的离子交换优点1<pH<12高容量（meq/g） 缺点机械稳定性不好会收缩或膨胀机械稳定性不好能耐受的有机溶剂的量是有限的目前九页\总数四十四页\编于五点离子交换能力指交换剂结合离子的能力通常填料meq/g来装填若不考虑填充密度，可引起误解（canbemisleading）聚合物型：5meq/g,密度0.2g/ml→1meq/ml硅胶型：1.5meq/g,密度0.5g/ml→0.75meq/ml容量越大，需要越强的流动相洗脱强度对弱离子交换，取决于流动相的pH值目前十页\总数四十四页\编于五点交换能力与pH值的关系目前十一页\总数四十四页\编于五点在离子交换色谱中影响保留的因素流动相的离子强度（k）pH(k,α)抗衡离子的浓度(k,α)温度(k,α)影响平衡共存离子(α)有机溶剂(k,α)克服反相的影响/与疏水基团的相互作用色谱柱类型，强或弱离子交换剂目前十二页\总数四十四页\编于五点离子强度的影响目前十三页\总数四十四页\编于五点pH值的影响目前十四页\总数四十四页\编于五点不同离子的洗脱强度阳离子交换剂 Ba2+>Pb2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>Mn2+>Ag2+>Cs2+>Rb2+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+Li是最弱的阴离子交换剂 柠檬酸盐3->SO22->草酸盐2->I->NO3->CrO4->Br->SCN->Cl->]醋酸盐->OH->F-氟化物是最弱的目前十五页\总数四十四页\编于五点温度的影响流动相：1MKH2PO4，pH3.8柱温：60℃流速：4ml/min色谱柱：SilicaSCX40℃50℃60℃目前十六页\总数四十四页\编于五点IEC－应用氨基酸典型的应用，由Moore和Stein在上世纪50年代末发展而来蛋白质无机离子也称离子色谱目前十七页\总数四十四页\编于五点氨基酸的离子化目前十八页\总数四十四页\编于五点用IEC分离氨基酸色谱柱：阳离子交换柱洗脱剂A：0.2NNa+pH=3.0洗脱剂B：0.2NNa+pH=9.8梯度：0-100%Bin48min流速：0.4ml/min目前十九页\总数四十四页\编于五点用IEC分离蛋白质可应用于多有的蛋白质对生物活性有非常好的重现性对电荷差别特别小的蛋白质分离能力非常强对浓度小体积大的样品分离能力很好是可分离的质量数最高可有多种途径改善分离效果目前二十页\总数四十四页\编于五点选择离子交换剂类型的原则pl，等电点阳离子交换剂阴离子交换剂＋－pH蛋白质电荷是pH的函数目前二十一页\总数四十四页\编于五点用于蛋白质分离的离子色谱填料粒径：5-40μm色谱柱内径：5-50mm长度5-30cm类型阴离子阳离子强季胺磺酸磺酸盐弱二乙基氨乙基(Diethylamine,DEAE)羧甲基(Carboxymethyl,CM)目前二十二页\总数四十四页\编于五点选择合适的pH值净电荷数目前二十三页\总数四十四页\编于五点蛋白质表面电荷问题：你认为这三种蛋白质哪一种会最后一个被洗脱出来？注：这三种蛋白质的净电荷均等于－1目前二十四页\总数四十四页\编于五点pH值对蛋白质分离的影响色谱柱：Protein–PakDEAE8HR10×100mm（阴离子交换）流速：1.5ml/min梯度：0-200mMNaCl缓冲盐：20mMTRIS-HClC=Conalbumin（伴清蛋白）T=Transferrin（铁传递蛋白）O=Ovalbumin

（卵清蛋白）S=Soybeantrypininhibitor（大豆胰岛素抑制剂）目前二十五页\总数四十四页\编于五点pH梯度用于pH梯度的WatersAutoBlendTM

方法目前二十六页\总数四十四页\编于五点蛋白质的分离－反离子的影响色谱柱：Protein–PakDEAE8HR10×100mm(阴离子交换)流速：1.5ml/min缓冲盐：20mMTRIS-HClpH7.5梯度：0-200mMNaCl0-200mMNaAcetateC=Conalbumin（伴清蛋白）T=Transferrin（铁传递蛋白）O=Ovalbumin

（卵清蛋白）S=Soybeantrypininhibitor（大豆胰岛素抑制剂）NaClNaAcetateCTOSSCTO目前二十七页\总数四十四页\编于五点蛋白分离的共离子效应色谱柱：Protein–PakSP8HR10×100mm(阴离子交换)流速：1.5ml/min梯度：0-300mMNaCl缓冲盐：20mMNaPhosphatepH5.520mMNaAcetatepH5.5A=AlphaChymotrypsinogen(α胰凝乳蛋白酶原)R=RibonucleaseA（核糖核酸酶）C=CytochromeC（细胞色素)L=Lysozyme(溶解酵素)目前二十八页\总数四十四页\编于五点IEC分离无机阴离子色谱柱：WaterIC-PakAHR洗脱：硼酸盐/葡(萄)糖酸盐流速：1.0ml/min检测器：电导检测器目前二十九页\总数四十四页\编于五点IEC分离无机阳离子色谱柱：WaterIC-PakCM/D洗脱：3.0mMHNO3流速：1.0ml/min检测器：电导检测器1.锂2.钠3.氨4.钾5.镁6.钙7.锶8.钡目前三十页\总数四十四页\编于五点体积排阻色谱气相色谱液相色谱吸附/分离液相色谱离子交换体积排除色谱凝胶渗透/凝胶过滤目前三十一页\总数四十四页\编于五点SEC的机理待测无经过一个多孔凝胶固定相凝胶孔径可能是一种也可能是几种的混合，取决于所选用的柱子分离取决于在溶液中的大小而不是分子量大的先出，小的后出流向凝胶颗粒凝胶颗粒目前三十二页\总数四十四页\编于五点体积排阻色谱中保留体积与分子量的关系目前三十三页\总数四十四页\编于五点SEC定义凝胶过滤（GFC）此名词原用于描述生物聚合物SEC，现在也指水相SEC。蛋白，多糖等，洗脱液常为水相。凝胶渗透（GPC）此名词原用于描述有机聚合物SEC，现在也指有机相SEC。聚乙烯，聚丙烯等，洗脱液常为有机相，如THF或甲苯。常采用高温90－140℃（高温GPC）目前三十四页\总数四十四页\编于五点硅基团水相SEC柱目前三十五页\总数四十四页\编于五点聚合物型水相SEC柱交联环氧丙氧基甲基丙烯酸酯表面含有醇或二醇官能团亲水性，阻止与极性化合物的反应表面通常有负电荷疏水性待测组分可与反相填料发生作用交联聚乙烯醇目前三十六页\总数四十四页\编于五点聚合物型色谱柱的工作曲线目前三十七页\总数四十四页\编于五点蛋白的校正曲线实例目前三十八页\总数四十四页\编于五点在水相SEC中影响洗脱的因素色谱柱类型/孔大小粒径流速离子强度（克服IEX与表面的负电荷的反应）有机溶剂（克服与反相疏水填料的反应）柱温目前三十九页\总数四十四页\编于五点多酶混合物用SEC进行初步纯化色谱柱：Protein–Pak60+125+300SW洗脱液：100mM磷酸盐pH7.4流速：2ml/min样品：5mg酶混合样目前四十页\总数四十四页\编于五点凝胶渗透色谱由Moore在上世纪60年代在Dow化学公司开发的GPC是塑料工业的官方认可的方法，并被美国材料测试协会（ASTM）所采用，用于测聚合物分子量聚乙烯（Polyethene，PE） 塑料袋聚丁二烯（Polybutadiene） 橡胶轮胎聚氯乙烯（Polyvinychloride，PVC） 合成革，水管聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA） 有机玻璃聚碳酸酯（polycarbonate） CD光盘目前四十一页\总数四十四页\编于五点聚合物分布聚合物科学家指出聚合物链的长度或大小作为其流体力学体积（hydrodynamicvolume）与分子量大小相关。分子量分布是组成一个聚合物的分子统计学的显示。聚合物有一系列的链长度的分布，因而产生分子量。分布的形状是聚合过程（游离基、缩合等）的反映。如果聚合物易于降解（热解、氧化…