分析前变异临床对生化检验的影响优秀课件

分析前变异临床对生化检验的影响第一页，共四十页，编辑于2023年，星期五

分析前变异是指在分析前阶段产生的各种变异。分析前阶段是实验医学最重要组成部份，包括从病人准备到样本收集等分析前过程。分析前阶段产生的变异直接影响采集样本的质量，即使分析仪器非常先进，而且室内和室间质控非常良好，最终仍不能得到可靠的结果。第二页，共四十页，编辑于2023年，星期五分析前变异可分成三大类。：一、生理性变异二、样本收集和处理过程的变异三、内源性干扰因素第三页，共四十页，编辑于2023年，星期五一、生理性变异生理性变异包括：年龄、性别、采血时间、季节、海拔高度、妊娠、月经周期和生活方式；

1.年龄年龄对实验结果的影响可以用不同的参考范围来区别。健康的生长期儿童的骨骼生长和发育表现为成骨细胞分泌，使碱性磷酸酶增加。因此，生长期儿童的碱性磷酸酶的活性比健康成人大约高3倍。第四页，共四十页，编辑于2023年，星期五1.年龄新生儿的红细胞计数高于成人，出生后大量RBC被破坏，使血红蛋白水平增加，血红蛋白在网状内皮系统中转变成间接胆红素，由于新生儿肝中缺乏葡萄糖醛酸转移酶，不能将间接胆红素转变成水溶性的结合胆红素，表现为血清中总胆红素和间接胆红素水平增加。年龄可以影响肾功能，表现为肌酐清除率的变化。肌酐清除率每隔10年会渐渐减少。例如：30岁左右的人肌酐清除率的平均值是每1.73m2体表面积140ml/min(2.33ml/s)；相反，80岁左右的人肌酐清除率减少到每1.73m2体表面积97ml/min(1.62ml/s)，50岁以上的人，肌酐清除率的减少还与肌肉的量减少有关。第五页，共四十页，编辑于2023年，星期五1.年龄抗利尿激素的水平与年龄相关。有研究表明，53到87岁的健康人（68人）抗利尿激素水平比21至51岁的健康人（45人）明显增高（53至87岁健康人的水平是4.7±0.3pg/ml，21至51岁健康人是2.1±0.2pg/ml）。甲状腺水平明显地受到年龄的影响。据报道，促甲状腺素水平在老年人群（平均年龄79.6岁）比青年人群（平均年龄39.4岁）高38%。而老年组血清三碘甲腺原氨酸水平比青年组低11%。上面的实例说明年龄的变化会影响某些生化检验的结果，因而在临床工作中对不同的年龄段制定不同的参考范围，而不能使用统一的参考范围。第六页，共四十页，编辑于2023年，星期五

2．性别

在15岁到55岁之间，总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）的水平女性比男性稍高，而高密度脂蛋白（HDL）的水平在15-55岁的男性和女性没有差异。和肌肉有关的分析项目如肌酐和肌酸激酶，男性的水平明显高于女性的水平。但是，运动量大的女性，其肌肉质量增加，肌酐及CK和男性相比没有差异。有报道曾对23项常规生化项目的分析结果进行性别统计分析，结果发现ALT、UA、BU、CREA、GGT、TC、CK、MG有性别差异。性别的差异可能是由于肌肉质量的不同或内分泌及器官特异性的不同而引起差异。由于这些项目有性别差异存在，因而需要对于不同的性别制定不同的参考范围。第七页，共四十页，编辑于2023年，星期五3．采血时间

某些分析项目有时间节律的变化。例如：皮质醇一般在早上6点左右出现峰值，晚上和午夜降低；促甲状腺激素水平峰值出现在深夜，中午时最低；生长激素的水平在清晨最低，睡眠中升高。一般情况下，激素均存在时间节律变化，但不必为不同的时间制定不同的参考范围，而需要统一采集标本的时间。第八页，共四十页，编辑于2023年，星期五4、季节性影响由于夏季暴露于日光中的时间较长，因而维生素D的水平会升高；总胆固醇水平在冬季比夏季平均增高2.5%；甲状腺三碘甲腺原氨酸水平在冬季比夏季增高平均20%。因此，当病人在不同的季节检查这些类的项目时，应考虑季节变化带来的影响。第九页，共四十页，编辑于2023年，星期五4、季节性影响春季－血清/血浆：↑AST、TG↓ALT、Glu、甲状腺激素、尿素夏季－血清/血浆：↑LD、肌酐、尿酸↓ALT、白蛋白、尿素秋季－血清/血浆：↑白蛋白、Ca、Glu、尿素↓AST、TG冬季－血清/血浆：↑ALT↓Ca、肌酐、LD、尿酸第十页，共四十页，编辑于2023年，星期五5．海拔高度

在海平面与较高的海拔高度相比较，血清中某些成份的水平会发生变化。例如:C反应蛋白在35600米高度时升高65%。一些分析物的浓度因高度增加而减少，如血浆中的肾素、转铁蛋白，尿肌酐，雌三醇及肌酐清除率等。当病人在两个差别很大的海拔高度做相同的检查时，对于结果的分析应考虑高度的影响。第十一页，共四十页，编辑于2023年，星期五6．月经月经周期是成熟女性的正常生理过程，在月经周期的三个不同时期，和生殖有关的多种激素发生不同的变化，因此，雌二醇、促卵泡激素、黄体生成素等的参考范围随月经周期的各阶段（即卵泡期、中期、黄体期）而不同。第十二页，共四十页，编辑于2023年，星期五7．妊娠

妊娠时血容量增加导致血液稀释，使微量元素的测定结果明显降低；在妊娠后期，胎盘产生雌激素和绒毛膜促生长激素，使血清葡萄糖的水平升高；妊娠期代谢需求增加使脂肪动员增加，使血清载脂蛋白AI、AⅡ、甘油三酯和总胆固醇（特别是LDL-C）大大增加。妊娠时胎盘生成热稳定碱性磷酸酶、甲胎蛋白、铜蓝蛋白、急性时相蛋白和凝血因子，使相应的检查结果升高。由于妊娠是特殊的生理过程，对于孕妇的检测结果应充分考虑妊娠的影响。第十三页，共四十页，编辑于2023年，星期五8．生活方式

饮食影响一些分析物的测定结果。非素食者的饮食是高蛋白或高嘌呤，其尿酸、尿素和氨的水平比素食者高。富含鱼油的饮食会降低血清中甘油三酯和极低密度脂蛋白（VLDL）的水平，可能是鱼油具有抑制VLDL和甘油三酯合成的能力。摄入咖啡因会影响一些分析物的结果，咖啡因抑制磷酸二酯酶的活性，使cAMP水平增高，cAMP活化甘油三酯酯酶导致游离脂肪酸浓度增加3倍。游离脂肪酸竞争白蛋白分子上结合位点，取代结合在白蛋白上的药物或激素，因此，影响了游离药物或激素浓度的测定。吸烟会对某些生化项目产生影响。如在1小时内抽4支香烟，血浆中肾上腺素、醛固酮、皮质醇、游离脂肪酸和游离甘油浓度会升高。第十四页，共四十页，编辑于2023年，星期五饮食的影响（一次标准餐后）甘油三脂增加50%；（至少应当在抽血前的3天以内注意保持正常饮食）天门冬氨酸转移酶增加20%；胆红素、无机磷和糖增加15%；丙氨酸转移酶和钾增加10%；尿酸、总蛋白、白蛋白、尿素、钙和胆固醇增加5%左右。由此看来，饮食结构的不同，对上述指标的影响也是不同的；因此大多数检验项目都要求在早晨空腹采血。在作内生肌酐清除率测定之前，待检者应禁食肉类3天，不饮咖啡和茶，停用利尿剂，试验前避免剧烈运动，饮足量的水。第十五页，共四十页，编辑于2023年，星期五

二、标本收集和处理的变异标本收集和处理的变异包括禁食时间、标本采集时间、采血时的姿势、使用压脉带、输液、运动、抗凝剂、稳定剂和标本处理等。标本收集和处理标准化，使分析前误差达到最小。

第十六页，共四十页，编辑于2023年，星期五1．禁食时间

被采血者在标本收集前应禁食一整夜（即至少12小时），禁食12小时的原因是脂肪餐后，血清中甘油三酯的水平可持续升高近9小时，而总胆固醇和载脂蛋白AI、AⅡ的浓度几乎无影响。但是，过长的禁食时间会影响实验结果。如：48小时禁食，肝的胆红素清除能力比一般情况下高240%，使血清间接胆红素浓度降低。如果延长禁食，一些特异性蛋白质，如补体、前白蛋白和白蛋白水平降低。因此，应统一禁食的时间，一般为12小时。第十七页，共四十页，编辑于2023年，星期五2．标本采集时间

标本采集时间要依据血循环中分析物水平的变化而定，保持每天标本采集时间恒定对于消除由日内变异造成的影响很重要。如激素的测定需要严格控制标本采集的时间。对于尿标本的采集时间依被测成分而定，对有日间变异的分析物进行测量，收集24小时尿标本是必要的。

第十八页，共四十页，编辑于2023年，星期五3．采血时体位的影响（1）许多血浆生化成份在站、坐、卧三种不同体位时有明显的浓度差异，长期以来，人们忽视了采血时体位变化对生化检测的影响。由于血液中直径大于4nm的成份不能通过血管壁转移至间质，使其血浆含量升高5—15%。直立位时血浆总量比卧位约减少12%，一般情况下，与仰卧相比，坐位时多数大分子物质（如白蛋白）的浓度升高5-15%。当检测HB、RBC、WBC、Hct、Tca、蛋白质和血脂时应相对固定体位。（2）建议门诊病人静坐5~10分钟后以坐位（从肘静脉）采血为最佳。（3）卧床患者可卧位采血。第十九页，共四十页，编辑于2023年，星期五4．压脉带时间的影响

(1)

使用压脉带可降低血管内压力，使其低于心脏收缩压，使小分子和液体从血管内移出至组织间隙，而不能通过毛细血管壁的大分子物质的浓度增加。使用压脉带过久，局部缺氧使无氧酵解增加，血浆中乳酸增高而pH值降低，pH值降低使钾从细胞内移出，引起血清钾假性升高。若采血时要求病人反复握拳可使K+增加1-2mmol/L，最高可至2.7mmol/L。pH值降低会改变药物-蛋白结合或激素-蛋白结合，使游离药物和游离激素浓度增加。(2)压脉带不应扎得太紧，扎脉的时间应尽量缩短。抽血时，见到回血应立即松开压脉带，减少血行阻滞时间（更不应该鼓励被抽血者长时间、用力攥拳）。第二十页，共四十页，编辑于2023年，星期五4、压脉带时间的影响(3)血脂项目、出凝血项目、血常规项目抽血时压脉带使用应限定在1分钟以内；压脉带扎脉小于1分钟，血样的各项检验指标无明显改变。(4)压脉带束缚太紧、时间过长，会造成血行阻滞时间过长，因溶血、血小板激活、纤溶系统激活等原因将使以上检验项目的结果；产生偏差，甚至诱导错误诊治压脉带扎脉3分钟后胆红素、胆固醇、转氨酶均会增加5倍以上。(5)需要重新采血时，在压脉带束缚时间太长的情况下，应当在对侧手臂重新采血。因此在抽血时，为了减少压脉带使用对实验结果的影响，应在针头一进入静脉后解开立即压脉带，并避免过度的握拳。第二十一页，共四十页，编辑于2023年，星期五5．输液

在实际工作时有发现罕见的高血糖值，其原因是从输液同侧手臂采血引起的。尽量避免输液时采血(1)一般情况下，输入脂肪乳剂的病人应在8小时后采血；输入碳水化合物、氨基酸、蛋白质或电解质的病人在1小时后采取血标本。(2)抢救过程中必须一边输液一边采血时，应避免从正在输液的肢体上采血，应避免输液成份混入血液标本，还应在检验申请单上注明。(3)输液时采血应当遵从“远端原则”：选择在输液的对侧肢体或无输液的其他肢体（如足部）静脉采血。在四肢静脉都输液时，可以选择在输液静脉的远心端（静脉血流的上游）采血。

第二十二页，共四十页，编辑于2023年，星期五6．运动的影响

运动时肾上腺素、去甲肾上腺素、糖皮质激素、促肾上腺皮质激素和生长激素的升高，而胰岛素减低。对于剧烈运动可以使许多血液成份发生改变，甚至持续24小时以上，还会产生一定程度的血管内溶血，使血浆中结合珠蛋白水平降低。为了减少由于运动引起的分析前的变异，应建议病人至少在试验前一晚上避免剧烈活动并在采血前避免长距离行走、跑步或爬楼。因此剧烈运动之后不应立即抽血；快步行走之后，至少应休息10~15分钟然后再抽血，应在平静状态抽血，避免情绪激动。

第二十三页，共四十页，编辑于2023年，星期五6．运动的影响①适量的运动：↑GLU、乳酸盐、肌酐、尿酸、AST、LD、CK、尿素↓pH、pCO2、胆固醇、TG②剧烈运动：↑糖蛋白、转铁蛋白、2-巨球蛋白、纤溶蛋白活性、PRA、氯化物、ACP、ALT、醛固酮、GH、PRL、儿茶酚胺、FFA、肌酐、尿素↓白蛋白、胆红素、Fe、LD、K、Na、总血脂尿液：↑游离皮质醇、儿茶酚胺、pH值第二十四页，共四十页，编辑于2023年，星期五7．抗凝剂

临床生化常用的抗凝剂为肝素的各种盐类，包括肝素纳、肝素锂和肝素铵。三种盐用于电解质的测定可得到相同的结果，但肝素锂优于其它两类，这是由于肝素钠可能引起钠水平的假性升高，以及用尿素酶测定尿素时，肝素铵可引起血清尿素浓度的假性升高。

第二十五页，共四十页，编辑于2023年，星期五8．稳定剂氟化钠（NaF）和碘醋酸锂可单独用于血液采集，也可用于草酸钾、EDTA、枸橼酸三钠和肝素锂等抗凝剂，用于抑制糖酵解的NaF的浓度为4.3mg/ml血，与抗凝剂合用时，如Na2EDTA或k2EDTA（1mg/ml血）或草酸钾（2mg/ml血），氟化物的浓度为2.5mg/ml血（60mmol/L）。不加入糖酵解抑制剂，在室温条件下，新生儿标本的血糖1小时降低24%，而健康成人标本的血糖水平降低5%。当标本采集后放置室温5小时后，Hct高的新生儿的不含糖酵解抑制剂的标本，血糖降低可达68%。第二十六页，共四十页，编辑于2023年，星期五9．标本的处理和保存

标本的贮存，分离血清、血浆或细胞的过程会引入变异，存在于细胞内的分析物需要从血液中快速分离。氟化物和碘醋酸盐需大约3小时来稳定糖的水平，这是因为不能够抑制糖酵解途径的的第一个酶--已糖激酶。氟化物作用于糖酵解途径的第八个酶--烯醇化酶，而碘醋酸盐作用于糖酵解途径的第五个酶--磷酸甘油醛脱氢酶，草酸钾能抑制丙酮酸激酶，氟化物和草酸钾一起使用能延缓血收集后1小时内乳酸的形成。多种方法用以提高抑制剂的功效。一种方法是：枸橼酸、枸橼酸三钠、EDTANa2和少量氟化钠(0.2mg)混合，通过维持血pH在5.3-5.9的范围来抑制糖酵解途径的酶反应。由于添加了抑制剂，室温下糖酵解可被抑制8小时,而24h后葡萄糖的均值±标准差下降0.07±0.06mmol/L。第二十七页，共四十页，编辑于2023年，星期五9．标本的处理和保存

另一种糖酵解抑制方法是添加甘露糖（已糖），由于甘露糖是葡萄糖的差向异构体，和葡萄糖竞争结合已糖激酶达到抑制糖酵解的作用。但是甘露糖是一个竞争抑制剂，其抑制作用仅保持4小时。如果加入了氟化物，可以得到一个更好的葡萄糖稳定性。当甘露糖浓度是3mg/ml时，用已糖激酶和葡萄糖氧化酶法测葡萄糖浓度，不会产生干扰。甘露糖浓度为9mg/ml，测定结果会增高1.0mmol/L。如果血标本收集后立即分离血浆，由于分解葡萄糖的酶存在于细胞内，血浆中的葡萄糖水平可长期稳定。第二十八页，共四十页，编辑于2023年，星期五三、内源性的干扰因素

内源性干扰非常广泛，主要的干扰物来源于药物及其代谢产物。目前，我们对于药物的干扰处于了解的状态，消除对测定方法的干扰还很困难。实际工作中不能解释的分析结果可能就是药物干扰产生的。目前，人们对于普通的干扰因素（如溶血和脂血等）进行了广泛的研究，掌握大量的相关知识。一般情况下，轻微的溶血对于许多常规临床生化实验方法的影响是微不足道的，而重度溶血对RBC中的浓度比血浆中浓度高得多的成分产生严重影响，对于RBC中浓度低于血浆中浓度的成分产生一个轻微的稀释效应。如：乳酸脱氢酶存在RBC中的浓度比在血浆中高160倍，酸性磷酸酶高68倍，AST高6.7倍，钾高23倍。当标本溶血时，这些项目的结果出现假性升高。对于脂血标本，脂质是一个方法依赖性的干扰物质，干扰来于机制的差异，如标本的不同种类，水的置换和亲脂成份的吸收。明显的高脂标本干扰可用电泳法和比色法测定总蛋白。第二十九页，共四十页，编辑于2023年，星期五三、内源性的干扰因素关于血气分析的分析前变异。包括：病人的仰卧姿势；在收集动脉血之前和收集过程中，是否停止吸氧；容器材料（玻璃还是塑料注射器）的影响；抗凝剂是干粉还是液体肝素；收集标本到分析之间的时间等等均应该标准化。分子生物学是另一个对分析前变异关注的一个领域。在细胞溶解时使用去污剂，不同类型的去污剂会影响PCR技术中的DNA扩增；溶血标本中正铁血红素对DNA聚合酶的影响；组织的处理，固定和固定时间等均会产生影响。第三十页，共四十页，编辑于2023年，星期五三、内源性的干扰因素随着现代技术的发展，新的生化标志物不断被推出，分析前变异的问题也随之出现。例如：同型半胱氨酸是心血管疾病的一个标志物，但是，在体外可由细胞生成，因此需要快速分离血清或血浆。分析前变异对检验医学会产生重要的影响，对于各种分析前的变异应充分了解，采取制定不同的参考范围、标准化收集标本等措施，控制分析前变异，提高检验质量。第三十一页，共四十页，编辑于2023年，星期五影响ELISA结果的若干内源性干扰因素内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质等。在日常的临床血清(浆)标本中，有相当比例不同程度的含有上述各种干扰物质，从而导致测定结果的假阳性。第三十二页，共四十页，编辑于2023年，星期五例：影响ELISA结果的若干内源性干扰因素1.类风湿因子(rheumatoidfactors,RF)干扰在类风湿患者和其他疾病以及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的RF，RF一般为IgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。避免其发生的方法有：(1)稀释标本：在测定前对标本进行稀释，特异的IgM因高滴度存在仍可检出，而非特异的RF则会因为稀释变成非常低的滴度，从而对测定几乎不产生干扰。(2)用F(ab)2替代完整的IgG。(3)标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理。(4)检测抗原时，可在标本中加入可使RF降解的还原剂：如2-s巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解。

注：F(ab’)2的片段。该片段由一对通过两个二硫键相连的Fab’单元组成。第三十三页，共四十页，编辑于2023年，星期五影响ELISA结果的若干内源性干扰因素2.补体的干扰在固相酶免疫测定中：（a）固相特异抗体和酶标二抗分子发生变构，从而其Fc段的补体C1结合位点被暴露出来，这样补体C1就成为一个中介物将二者交联起来，造成假阳性结果。（b）固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阳性结果或使定量测定结果偏低。排除的方法有：(1)对临床血清标本加热灭活补体：采用56℃30min加热可使标本中的补体C1灭活。(2)使用特异的鸡抗体IgY作为标记或固相抗体。鸡抗体不激活人的补体系统。因此，使用特异的鸡抗体，不会出现因补体激活而存在的假阳性和假阴性干扰。第三十四页，共四十页，编辑于2023年，星期五3.异嗜性抗体(heterophilieantibodies)的干扰天然的异嗜性抗体(lgG)可分为两类，一类可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合(85%的假阳性由其引起)。另一类可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的Fc区表位，但不与山羊和大鼠IgG的Fc区表位结合(15%的假阳性由其引起)。异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。异嗜性抗体引起干扰的排除方法有：(1)使用特异的兔F(ab’)2片段作为固相或测定酶标抗体。(2)在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。(3)使用靶特异的非Ig亲和蛋白(Affibody)替代固相或酶标抗体，采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄球A蛋白(SPA)联合文库的的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。(4)使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。第三十五页，共四十页，编辑于2023年，星期五4.抗鼠Ig抗体的干扰：抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的免疫测定有干扰，可产生假阳性。排除干扰的方法有：(1)使用特异的抗体F(ab’)2片段作为固相或测定酶标抗体。(2)在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig，封闭可能存在的抗鼠抗体。(3)使用特异的鸡抗体IgG作为固相和测定抗体。鸡IgG不与人抗鼠抗体反应。因而，用其作为固相或酶标抗体不会出现假阳性结果。第三十六