分子生物学常用技术凝胶电泳技术杂交技术

分子生物学常用技术凝胶电泳技术杂交技术第一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

凝胶电泳(Gelelectrophoresis)是分子克隆的中心技术之一。

1.琼脂糖凝胶用于分离200~1000bp的片段；操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高

2.聚丙烯酰胺凝胶用于分离5~500bp的片段；效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA

用于DNA测序；核苷酸多态性的分析3.1凝胶电泳技术第二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五第三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五3.1凝胶电泳技术

3.1.1琼脂糖凝胶电泳的原理3.1.2琼脂糖凝胶电泳的影响因素3.1.3琼脂糖凝胶电泳的应用第四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

琼脂糖Agarose主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性多糖分子。琼脂糖溶液冷却形成的琼脂糖凝胶Agarosegel呈网状结构，具有分子筛效用，可作为DNA电泳介质。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖Lowmeltingpointagarose，其机械强度无明显变化，但可被agarase水解。主要用于胶中DNA的直接酶促反应。3.1.1琼脂糖凝胶电泳的原理第五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五3.1.1琼脂糖凝胶电泳的原理

核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶作为电泳支持介质，其分子筛效应使得大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）对DNA染色，在紫外光下激发红色荧光，可直接确定DNA在凝胶中的位置。第六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五凝胶电泳原理-凝胶阻滞第七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

在凝胶电泳后，用适量溴化乙锭(ethidiumbromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，EB能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下激发出红色荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。可直接观察，即将电泳胶放置在紫外光下观察记录电泳图像。检测灵敏快捷，0.05μg的微量DNA可以清晰地检测出来。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子能吸收EB并发出荧光。但长期不能被降解，污染环境。溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。第八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五凝胶电泳原理-EB染色第九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五核酸电泳的指示剂核酸电泳常用的指示剂有两种：

⑴溴酚蓝

⑵二甲苯青，

溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝青色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。第十页，共五十五页，编辑于2023年，星期五3.1.2琼脂糖凝胶电泳的影响因素1．核酸的性质

——DNA分子的大小，构象2．凝胶孔径的大小

——凝胶浓度3．电场强度和电场方向

——电极，电压，电流4．缓冲液

——缓冲液组成和离子强度第十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五不同浓度琼脂糖的凝胶最适分离范围琼脂糖浓度（％，W/V)DNA分子的有效分离范围（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2第十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五水平式琼脂糖凝胶电泳仪第十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五a．DNA分子迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）。

b．琼脂糖浓度：logU=logU0Kr

胶浓度，U为迁移率，U0

为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose：0.5%：1-30kb；0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb。

c．DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

d．所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm。

e．碱基组成与温度：一般影响不大，4-30℃。

f．嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)。

g．电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，0.5×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）。影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素第十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五3.1.3琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳应用——PCR产物检测琼脂糖凝胶电泳应用——酶切产物电泳检测琼脂糖凝胶电泳应用——RFLP分析琼脂糖凝胶电泳应用——核小体DNA分析琼脂糖凝胶电泳应用——凋亡细胞DNA分析琼脂糖凝胶电泳应用——凝胶阻滞分析琼脂糖凝胶电泳应用——凝胶足迹法分析琼脂糖凝胶电泳应用——DNA印迹电泳琼脂糖凝胶电泳应用——正交场脉冲电泳第十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳应用——PCR产物检测第十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳的应用——酶切产物电泳检测第十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳的应用——RFLP分析第十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳的应用——核小体DNA分析第十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳的应用——凋亡细胞DNA第二十页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳的应用——凝胶阻滞分析Gelretardationanalysis第二十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳的应用——凝胶足迹法分析第二十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳的应用——DNA印迹电泳第二十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五琼脂糖凝胶电泳的应用——正交场脉冲电泳第二十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。RNA电泳第二十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五RNA甲醛变性凝胶电泳图像第二十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，只要在DNA或DNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。

这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。

核酸分子杂交实质是双链DNA的变性和具有同源序列的两条单链的复性过程。3.2.1核酸分子杂交基本原理

Nucleicacidhybridization第二十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五核酸分子杂交基本原理第二十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五第二十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子第三十页，共五十五页，编辑于2023年，星期五第三十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五复性RNADNA第三十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是基因组DNA,细胞总RNA或克隆的基因片段等。将标记的已知核酸片段作为探针(probe)，与待测样本核酸进行杂交反应，即可观察到样本核酸中相应的序列。二、探针的种类与标记探针(probe)：一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC（硝酸纤维素滤膜）膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。探针的选择与标记是杂交技术成功与否的关键。(一)探针的种类基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。1.基因组DNA探针：DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。第三十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，以细菌为例，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。

DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。第三十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五2.cDNA探针：

cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经逆转录酶催化产生的。利用mRNA反转录合cDNA，经PCR扩增可制备大量cDNA探针。比较理想的核酸探针，但不易获得。3.RNA探针：是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，很少含有重复序列，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。来自从细胞中直接提取mRNA或利用DNA合成仪上合成小片段的RNA。

RNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。4.寡核苷酸探针:(人工设计，合成)

寡核苷酸探针具有一些独特的优点：①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，这是因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这种探针价格低廉。第三十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五（二）探针的标记方法核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有32P和35S。前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制（32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I的半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β放射线能量太低（0.018Mev），只能用于组织原位杂交。

1.

放射性核素的标记（1）切口平移法：该技术由Kelly等于1970年创立。是目前最常用的一种脱氧核糖核酸的探针标记法。是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，从而合成高比活的均匀标记的DNA探针。线状、超螺旋及带缺口的双链DNA匀可作为模板。首先，极微量的DNaseⅠ在Mg2+的存在下，在DNA链上随机形成单链切口。利用大肠杆菌DNA聚合酶的5`→3′核酸外切酶活性在切口处将从旧链5`—末端逐步切除。同时，在DNA聚合酶Ⅰ的5`→3′聚合酶活性的催化下，第三十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

顺序将dNTP连接到切口的3`末端—OH上，以互补的DNA单链的模板合成新的DNA单链。如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸（如32P—dCTP），则这些标记的核苷酸将替代原来的核苷酸残基，从而形成高放射性活性的DNA探针。（2）随机引物法(randompriming)所谓随机引物法是含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片段的混合物，因此它可以与任意核酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用。将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，在Klenow片段的催化下，合成与探针DNA互补的新DNA链。当在反应液中含有[α-32P]-dNTP时，即形成放射性核素标记的DNA探针。5`3`第三十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五（3）末端标记法：该法需要DNA分子末端带有羟基，而人工合成寡核苷酸的5`端本身即为羟基。如果要标记的DNA分子的5`端为磷酸基团，必须用碱性磷酸酶催化切除5`末端的磷酸基团，然后才能标记。其原理利用多核苷酸激酶将[r-32P]ATP分子上r位磷酸基转移至寡核苷酸链的5`末端，也可在3`端标记。2.

非放射性的标记法按标记方法不同，可分为两类：一种是预先已连接在NTP或dNTP上，因此可象放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸探针上，如生物素、地高辛等。另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上，即化学标记法。（1）生物素标记探针：生物素可与dUTP共价结合，用其标记的dUTP可代替dTTP掺入DNA探针，该探针能与抗生物素蛋白特异结合，而抗生物素蛋白上结合碱性磷酸酶可使反应中的底物显色，从而指示探针所在位置。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也可达到pg水平，可用于外源基因的检测。（2）地高辛配基标记探针：用地高辛标记过的dUTP可代替dTTP掺入DNA探针，可与酶或荧光色素结合的地高辛配基抗体直接检测，或间接使用免疫荧光法进行检测。

第三十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：ABC荧光标记GCTTGAGCAGTAACCTG荧光胺Biotin生物素Avidin生物素结合蛋白烷烃连接臂第三十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：ABC显色酶标记GCTTGAGCAGTAACCTG显色酶Biotin生物素Avidin生物素结合蛋白烷烃连接臂生色底物颜色产物第四十页，共五十五页，编辑于2023年，星期五克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：地高辛系统标记dUTP-连接臂-甾醇半抗原digoxigeninDIG抗体-显色酶交联复合物第四十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五（3）辣根过氧化物酶(HRP)标记探针：将HRP与聚乙烯亚胺结合，然后与DNA结合，产生酶标记的探针，杂交后利用酶促反应使底物显色即可指示探针位置。

三、核酸分子杂交技术(类型：液相杂交和固相杂交。)液相杂交指使变性的待测核酸单链与标记的探针在溶液中保温，使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然后计算杂交分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。固相杂交（solid-phasehybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。印迹方法：1)可直接将核酸样品点样于固相支持物上，称为斑点及狭缝印迹杂交(dot/slotblothybridization);2)毛细转移:本方法由Southern发明,故称为:Southern(blothybridization)印迹。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其它仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。3)利用电场作用的电转移法；4)利用真空抽滤作用的真空转移法。第四十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

液相核酸分子杂交第四十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五第四十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

第四十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五（一）Southern转移印迹杂交法

第四十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五分子杂交实验①②③目录第四十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五目录鸡的β肌球蛋白的克隆和检出第四十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五DNA印迹杂交第四十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五