浅论EphrinA1基因小干扰RNA的构建及其在Huh

浅论EphrinA1基因小干扰RNA的构建及其在Huh【摘要】目的：构建针对EphrinA1基因的发夹状RNA表达载体，观察其对人肝癌细胞Huh-7中EphrinA1基因表达的特异性抑制效应。方法：设计合成针对EphrinA1mRNA的RNAi核苷酸片段，并定向克隆到载体中，构建重组质粒SiRNA，同时构建不针对任何序列的重组质粒，通过脂质体介导转染入Huh-7细胞，应用逆转录聚合酶链反应检测小干扰RNA的沉默效应。结果：酶切鉴定证实和重组质粒构建成功，转染Huh-7细胞后，组EphrinA1mRNA表达较组和空白对照组明显下调，差异有统计学意义。结论：载体的成功构建为下一步研究以EphrinA1基因为靶位点的肝细胞癌基因治疗奠定了重要的实验基础。

【关键词】EphrinA1；小干扰RNA；肝细胞癌

Abstract:Objective:ToobservetheinhibitioneffectofShRNAonEphrinA1expressioninhepatomacelllineHuh-7throughconstructionoftheexpressedcarrierofEphrinAI.Methods:TwopairsofSiRNAweredesignedandsynthesizedaccordingtotheEphrinA1mRNAsequenceinGenBank，andthenwereinsertedintoplasmidstocreaterecombinantplasmidsand(control).AfterbeingtransfectedintoHuh-7cells，EphrinA1expressedbyShRNAswasdetectedtobedownregulatedbyRT-PCR.Results:Allplasmidswereconstructedsuccessfully.ExpressionofEphrinA1inHuh-7cellsinfectedwithplasmidswassignificantlydownregulatedcomparedwiththatisinfectedwithplasmids(P＜）.Conclusion:Con-structionoflaysanimportantexperimentalfoundationforgenetherapyofhepatocellularcarcinoma(HCC)bytargetingtheEphrinA1gene.

Keywords:EphrinA1；SiRNA；HCC

受体酪氨酸激酶已经被公认为血管生成的重要信号分子，Ephrin配体及其受体Eph是其中最大的一个亚家族，其在肿瘤血管生成中的作用受到越来越多的关注[1]。近期有日本学者用cDNA微列阵分析显示EphrinA1在AFP相关的肝细胞癌中是最多过度表达的基因。我们的前期研究也表明，在人肝癌组织切片中EphrinA1蛋白的表达明显增高并与其血管生成明显相关；EphrinA1的高表达与肿瘤的转移侵袭能力密切相关。本实验拟构建靶向EphrinA1基因的RNA干扰重组体，通过沉默Huh-7肝癌细胞中EphrinA1基因的表达，以期为下一步探讨EphrinA1基因在肝细胞癌发生、发展及血管生成中的作用提供有力支持。

1材料和方法

材料

Huh-7肝癌细胞株由湖南湘雅中心实验室提供；质粒购自美国Ambion公司；T4连接酶及各种限制性核酸内切酶均购自美国Promega公司；脂质体Lipofectamine

2000购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、逆转录聚合酶链反应试剂盒购自TaKaRa公司；RT-PCR引物由上海生工合成。

EphrinA1-siRNA转录模板的发夹结构设计

将EphrinA1的mRNA全序列输入到SiRNASepuenceSelector中，筛选出一个19nt的靶序列，阴性对照将SiRNA片段顺序打乱。SiRNA靶序列为5’-ACCACAGGCAT

AAGCTATC-3’，ScrambleSiRNA靶序列为5’-CACACCATAATAAGGGTCC-3’。然后用SiRNAHairpinOligonucleotideSequenceDesigner软件设计成能与载体相连接的双链发夹结构。

序列结构为BamHI+sense+loop+antisense+终止信号+SalI+HindIII。

实验组DNA模板序列为：

5’-ACCACACCACAGGCATAAGCTATCTTCAAGAGAGATAGCTTATGCCTGTGGTTTTGCAATTCACAGCTT-3’

3’-TGGTGTGGTGTCCGTATTCGATAGAAGTTCTCTCTATCGAATACGGACACCAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’

阴性对照组DNA模板序列为：

5’-ACCACACCACGAGCATAAGCTATCTTCAAGAGAGATAGCTTATGCTCGTGGTTTTGCAATTCACAGCTT-3’

3’-TGGTGTGGTCTGCGTATTCGATAGAAGTTCTCTCTATCGAATACGGCCACAAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’

交由上海博亚公司合成。

插入片段的退火和连接

将合成的寡核苷酸链溶解在ddH2O中，各取1μL正义和反义寡核苷酸链溶液，再加入48μL退火缓冲液，充分混匀，配制成50μL溶液，在PCR仪上95℃孵育4min，70℃孵育10min，缓慢冷却至4℃；以HindIII，BamHI双酶切质粒，使载体线性化，取退火后的插入片段溶液1μL+线性化质粒5μL+T4连接酶2μL+T4连接酶缓冲液2μL在4℃下过夜。分别命名为和。

重组质粒转化宿主菌以及质粒的提取和鉴定

以常规方法制备并转染感受态宿主菌DH5α，质粒的提取则按产品说明书进行，最后提取的质粒DNA，经SalI和EcoRI双酶切鉴定。

质粒转染

采用Lipofectamine2000脂质体介导的转染法。在转染前一天，换液后调整Huh-7细胞密度为2×105/mL，以每孔2mL接种于6孔板，待细胞增至80%融合时，将质粒、脂质体按体积比1:6混合后转染至细胞中，操作按照说明书进行。

细胞内总RNA的提取及RT-PCR

采用Trizol一步法提取总RNA；逆转录得到cDNA后行PCR反应；EphrinA1：正义5’-AACAAGCTGTGCAGGCATGG-3’，反义5’-CTCCACAGATGAGGTCTTGC-3’，产物230bp；GAPDH引物：正义5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’，反义5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’；扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性50s，49℃退火45s，72℃延伸50s，28个循环，72℃延伸10min，4℃降温。结果观察PCR产物经2%琼脂凝胶电泳，EB染色检测，用凝胶成像分析系统对DNA条带扫描，并分析结果。

统计学处理方法

采用方差分析。

2结果

和质粒酶切鉴定

根据载体的限制性内切酶图谱，质粒载体中无SalI的酶切位点，而在我们的插入序列里面加入了SalI的酶切位点，其酶切点在793bp位置，质粒本身在397bp处有单一的EcoRI位点，双链寡核苷酸片段则插在BamHI和HindIII中间，因此和重组质粒均可用EcoRI和SalI双酶切进行鉴定。两重组质粒双酶切后均可切出大小为456bp的DNA片段，电泳结果与预期结果一致。

重组质粒的沉默效应

RT-PCR结果显示：转染48h后组的EphrinA1mRNA表达水平较组和空白对照组明显下调，三者的灰度比值分别为±、±和±，前者的灰度比值与后二者相比均明显降低，其差异均有显着性，而后二者灰度比值差异无显着性。

3讨论

RNA干扰现象，是由双链RNA介导的，在转录后水平关闭相应的基因序列表达的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默。它由Fire于1998年在秀丽隐杆线虫的研究中首先发现并报道。用RNAi技术可以高效、特异、快速地抑制细胞内癌基因的表达，使癌症表型逆转或病程得以控制。和其他基因干预技术相比，RNAi具有两个明显的特征：抑制基因表达的高效性和高度的基因序列特异性——这为我们进行人肿瘤细胞的RNAi抑制特异基因表达的研究提供了理论基础。

血管生成是实体瘤生长的基础，又是转移的重要途径。肝细胞癌为典型的多血管型肿瘤，故抗血管生成治疗具有重要意义。Eph/Ephrin是新近发现的受体酪氨酸激酶家族成员，其在肿瘤血管生成中的作用已经受到广泛的关注。研究证实EphrinA1可通过与其受体结合，激活下游的信号传导通路，从而调控内皮细胞的激活、黏附、转移以及渗透，最终影响如乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌等多种肿瘤的血管生成。同时针对Eph/Ephrin系统的抗肿瘤及抗血管生成基因治疗均显示出巨大的潜力[10]。我们的前期研究表明在人肝癌组织切片中EphrinA1的表达明显增高并与其血管生成明显相关；EphrinA1的高表达与肿瘤的转移侵袭能力密切相关。

在本实验中我们成功地构建了针对EphrinA1基因的RNAi序列，并克隆至载体中，下一步我们将进一步检测EphrinA1基因沉默后对人肝癌细胞Huh-7生物学行为的影响，以探讨EphrinA1基因在肝细胞癌发生、发展及血管生成中的作用，以期能为临床上肝细胞癌的治疗提供新的靶点。

【参考文献】

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ThakerPH,Deav