乙肝病毒的变异和临床意义医学课件

乙肝病毒的变异和临床意义乙型肝炎病毒感染引发慢性乙型肝炎以及相关肝硬化、肝细胞癌和肝功效衰竭是全球范围内关键医学和公共卫生问题。抗病毒诊疗是这一类慢性肝病根本诊疗方法。干扰素α和核苷（酸）类似物（NA)是两类关键抗病毒诊疗药品。但长久使用NA,耐药是一个突出问题。所以,认识耐药、防范耐药含相关键临床意义。一、乙肝病毒研究简史二、乙肝病毒结构及复制三、病毒变异:S、C、P、X区四、病毒耐药概念和危害五、常见抗病毒药耐药位点六、预防和监测一、乙肝病毒研究简史1965年Blumberg发觉澳大利亚抗原1967年发觉其与肝炎相关,称为肝炎相关抗原1970年Dane发觉HBV完整颗粒1972WHO将澳大利亚抗原命名为乙型肝炎表面抗原（HBsAg)1979年Galibert完成了HBV全基因测序HBsAg发觉曾获诺贝尔医学奖二、乙肝病毒结构及复制乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科,HBV基因组由不完全环状双链DNA组成,长为负链、短为正链,负链含3200bp,正链长度约为负链50-80%。HBV有四个ORF均位于负链,分别称作s区、C区、X区和P区,分别编码外膜蛋白、关键蛋白、X抗原和DNA多聚酶。HBV进入肝细胞后,病毒核酸进入细胞核并转换成cccDNA(共价闭合环状DNA),以此为模板,转录成四种HBVRNA,其中只有3.5kbmRNA含病毒DNA序列上全部遗传信息,所以也称为病毒前基因组RNA。它与病毒聚合酶一起被核壳蛋白包裹,包装成病毒关键。在病毒关键内前基因组RNA经过逆转录合成负链DNA,再以负链为模板合成正链DNA,一部分再进入细胞核补充消耗cccDNA,另外一部分则在内质网中装配包膜,形成成熟病毒颗粒向细胞外分泌。HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程慢性活动型乙肝患者肝细胞天天能够产生1013个HBV颗粒,在外周血中浓度可达1012/ml,半衰期1～1.2d。被HBV感染肝细胞半衰期为10天~100天不等。肝细胞内cccDNA半衰期较长,依据数学模型分析,排除宿主特异性免疫反应以及病毒变异影响,需要进行抗病毒诊疗才能完全清除患者肝细胞内cccDNA。现在无药品可作于cccDNA,其稳定存在是HBV不能根治原因。

三、病毒变异病毒变异是生物遗传进化肯定,乙型肝炎病毒(HBV)变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生。在外来压力作用下,HBV常发生选择性变异,部分特异性HBV突变株被选择出来。HBVDNA每个复制循环中每10000个碱基对可发生1个核苷错误,天天产生3.2×1010个点突变。HBV逆转录过程中缺乏校正机制是HBV轻易耐药根本原因。1、S基因区变异S基因区可分为:前S1、前S2和S区,分别编码preS1、preS2和HBsAg。前S蛋白免疫原性很强,可与肝细胞受体结合,是HBV含有嗜肝性关键原因。因为S基因编码HBsAg,所以其变异会产生以下不良临床结果:(1)HBsAg阴性乙肝病毒感染:S基因变异后所表示HBsAg不能被现在一般检验方法检测到,致使乙肝病毒仍然存在,却不被发觉。对这种情况,应该结合HBeAg检验和乙肝病毒基因检验技术,方可得出正确结果。

(2)免疫预防失败:使用野毒株HBsAg制备血源性或基因过程乙肝疫苗所产生抗HBs对部分变异株HBsAg亲和力和中和作用显著下降,从而可使乙肝疫苗阻断母婴传输和乙肝免疫球蛋白预防移植肝再感染乙肝病毒失败。

(3)致病性改变:S基因变异株在乙肝病毒无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化和肝癌患者体内都有发觉,使病变程度加重,范围增加。

(4)HBsAg亚型改变:因为核苷酸序列发生变异,会引发HBsAg亚型改变,使病情复杂化。总而言之———S基因变异是疫苗免疫失败关键原因S基因变异后免疫球蛋白将不能发挥保护作用逃避干扰素诊疗和宿主免疫清除S基因变异是形成HBsAg阴性、抗HBs阳性、HBV-DNA连续阳性慢性乙型肝炎关键原因2、前C/C基因变异C1896位(A83)变异:是HBV中最常见变异。nt1896G-A,使28位色氨酸（密码子TGC）变异为终止密码TAC,造成前C蛋白翻译终止,从而使eAg不能合成。此突变有利于HBV逃避免疫攻击但它并不影响HBV复制,而形成慢性感染状态。这种情况临床上表现为HBeAg(-)、HBV-DNA(+)。

上述变异也见于干扰素诊疗后,所以提醒以HBeAg转阴作为疾病好转指标有时并不正确,应结合HBVDNA检测判定。

前C区/C区突变检测临床意义判定e抗原下降代表病毒复制能力下降诊疗是否可靠判定乙肝病毒是否为特殊e抗原阴性病毒类型慢性重症肝炎、肝硬化失代偿、原发性肝癌与C区位点突变相关对判定疾病预后,调整抗病毒诊疗方案含有一定参考价值是否是真血清学转换C区变异使得细胞毒T淋巴细胞(CTL）效应降低3、X基因突变X基因突变编码154个氨基酸X蛋白,X蛋白可激活乙肝病毒基因复制过程,是乙肝病毒基因组内结构和功效重合最显著区域。所以,X基因在乙肝病毒复制、表示及致病中起关键作用。多年来还发觉乙肝病毒X基因变异及其产物HBxAg与乙肝病毒致癌亲密相关。4、P基因变异

P基因关键编码DNA多聚酶,是最长开放读框,与C、S与X基因重合。该基因共分成5个区(A、B、C、D和E)。这些区域是较保守,参与核苷酸或模板结合,而且含有催化活性。近10多年来,在用核苷类药品诊疗患者中,出现了P基因突变,体内外试验表明这些突变株与药品耐药相关。

四、病毒耐药概念和危害在核苷(酸)类似物诊疗过程中,从病毒变异到临床耐药是一个逐步发生过程。最初,体内可能有少许变异病毒株。尽管这些病毒对药品抵御力强,但其复制数量比野生病毒株少。所以,体内野生病毒株仍占“优势”,但伴随诊疗时间延长,野生病毒株被药品抑制住以后,耐药变异病毒株被“筛选”出来,得到复制机会,并逐步增多,成为体内“优势”株,这时便出现耐药。与DNA-P结合抑制HBV-DNA复制核苷类似药品作用机制图.抗病毒诊疗后HBV从病毒变异到临床耐药为了正确地反应这种病毒变异到临床耐药过程,我们把病毒变异后耐药分为基因耐药、病毒学耐药和临床耐药三个阶段——基因耐药:在抗病毒诊疗过程中体内乙肝病毒基因组产生了变异,形成新耐药性病毒基因序列,对药品易感性降低,但这种耐药病毒株在体内量极少,只能经过病毒基因检测查到变异病毒株。*（表型耐药）病毒学耐药:在基因耐药基础上继续发展,变异病毒株逐步增多,HBVDNA水平反弹,通常在(1×103)～(1×106)拷贝/毫升之间,还没有造成肝功效异常和显著肝脏组织学损伤。病毒学耐药也称为病毒学反弹。美国NIH会议提议其定义为:诊疗后达成应答,但在继续诊疗过程中HBVDNA比达成最低值一致性地超出1log10拷贝/ml时,称为病毒学反弹。临床耐药:病毒学耐药继续发展,HBVDNA水平上升至1×106拷贝/毫升以上,最终出现ALT升高、肝脏组织学损伤,并可能有临床症状。病毒耐药对临床影响耐药病毒出现使后续诊疗药品疗效降低耐药病毒出现使后续诊疗药品选择降低耐药病毒出现抵消了之前取得临床益处病毒反弹,血清转氨酶升高,HBeAg血清转换率降低肝硬化病人出现肝功效失代偿和死亡肝移植后肝炎复发率增高公共卫生危害耐药病毒株传输免疫逃逸五、常见抗病毒药耐药位点

拉米夫定耐药位点:病毒最关键变异发生在YMDD位点。YMDD是4个氨基酸(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)缩写,这4个氨基酸位于乙肝病毒DNA聚合酶上,是拉米夫定关键作用位点,最常见变异是M(蛋氨酸)被V(缬氨酸)或I(异亮氨酸)替换,分别称为YVDD或YIDD变异(即:M204V/I)。一旦发生了YMDD变异,拉米夫定对HBVDNA抑制作用就会降低1000倍以上。当长久应用拉米夫定时,发生YMDD变异比率逐年增加。举例1:略阿德福韦耐药位点:关键为N236T(苏氨酸置换门冬酰胺)或A181/T(缬氨酸/苏氨酸置换丙氨酸)。体外检测,这些变异株对阿德福韦易感性降低3～10倍,含有这些变异株患者可伴有病毒学反弹、肝炎发作和肝功效失代偿。其她耐药株有215、237和238位点变异,但需深入确定这种变异临床意义。举例2、举例3:略恩替卡韦耐药位点:P区184、202和250位点发生氨基酸置换变异,认为与发生恩替卡韦耐药相关,使其对药品易感性降低<10倍。在原有拉米夫定耐药患者中,病毒对恩替卡韦感性降低8～30倍。恩替卡韦属于高基因屏障药品,耐药方法:rtL180M+rtM204V耐药位点再出现rtT184,或S202,或M250位点改变,也就是必需同时出现3个耐药位点。替比夫定耐药位点:其抑制HBV复制活力较拉米夫定强,但二者有交叉耐药,对有M204I变异或L180M/M204双重变异拉米夫定耐药患者,替比夫定敏感性也一样降低1000倍以上;但替比夫定对单独M204变异株仍有抑制作用,其易感性仅降低1～2倍。对阿德福韦耐药株A181易感性降低3～5倍,但对N236T变异株仍敏感。以上能够看出,拉米夫定、替比夫定有交叉耐药性,恩替卡韦与前二者有部分交叉耐药性,而阿德福韦耐药位点独特,与以上三种药品均无交叉耐药性。干扰素诊疗对HBV压力关键集中在前C/C区及前S区。最近对前C区基因变异研究显示,干扰素诊疗并不增加前C区基因变异机会,前C区终止变异也不影响干扰素诊疗应答,但在干扰素诊疗过程中产生前C区变异往往可预示病毒清除失败。出现机体耐药可能与中和抗体产生相关。

病毒对不一样抗病毒药品“基因屏障”是不一样,所以药品耐药发生率也不一样。所谓病毒对药品基因屏障是病毒变异或逃逸药品选择造成病毒耐药阈概率。有高耐药基因屏障药品,病毒耐药危险性较低;而低耐药基因屏障药品,病毒耐药危险性较高。图2.多种抗病毒药品耐药发生率六、预防和监测抗病毒诊疗期间所达成病毒抑制程度,既是决定预后最关键指标,也是估计耐药发生好方法。多年来,路线图概念是为了估计疗效及耐药而提出来。Roadmap估计概念KeeffeEB,etal.ClinicalGastroenterolHepatol;5:890–897.12周检测最初无应答病毒学应答早期诊疗失败依从性良好依从性不好24周检测早期应答PCR检测阴性完全病毒学应答介于≥300和<104copies/ml部分病毒学应答≥104copies/ml病毒学应答不好开始诊疗加用第二种药品继续原方案诊疗每6个月监测一次初始选择低耐药基因屏障药品:加用不一样变异位点药品初始选择高耐药基因屏障药品:每3个月监测一次,连续超出48周初始选择抗病毒疗效弱药品:每3个月监测一次,连续至48周48周时完全应答,继续诊疗48周时不完全应答,加用疗效更强而且不交叉耐药药品诊疗期间病人监测目是评定药品安全性、依从性和有效性。尤其是早期病毒学应答情况对发觉原发性诊疗失败和估计长久疗效非常有价值,能够估计长久诊疗可能发生组织学改善、降低肝病进展和/或耐药。第一个监测点是在诊疗12周时,假如血清HBVDNA下降小于1log10IU/ml或50copies/ml,称为原发性诊疗失败。原发性诊疗失败是罕见,假如不是因为病人依从性问题,对于原发性诊疗失败病人应该改变诊疗方案。第二个监测时间点是诊疗24周时病人血清HBVDNA水平。24周时疗效分为完全应答、部分应答或不充足应答。完全应答定义为:HBVDNA<60IU/ml或<300copies/ml(PCR法)。完全应答病人继续服药,延长到每6个月随访并检测一次。部分应答定义为:诊疗24周时HBVDNA<IU/ml(<4log10copies/ml)。部分应答病人如使用耐药基因屏障较低药品,应考虑增加第二种无交叉耐药性药品,预防病毒耐药后反弹;如使用耐药基因屏障较高药品,应该继续每3个月监测一次直到48周以后;如使用抗病毒作用较慢药品(如:阿德福韦),应该继续每3个月监测一次;到诊疗48周时,如仍为部分应答或不充足应答,应改变诊疗药品,除非HBVDNA靠近可检测下限;如在诊疗48周时达成完全应答,应继续诊疗。不充足应答被定义为:在诊疗24周时,HBVDNA≥IU/ml(≥4log10copies/ml)。病毒耐药预防1．使用抗病毒疗效理想和有高耐药基因屏障药品。在现在上市乙肝抗病毒药品中,干扰素疗程短,不引发病毒耐药;在口服抗病毒药品中,选择高耐药基因屏障药品。2．规范诊疗和提升病人诊疗依从性诊疗规范性和病人依从性可降低耐药发生,假如不根据要求随意更换药品、不按时服药或随意停药,就会增加病毒耐药机会及其她危害（举例4:略）。3.掌握好抗病毒指征及停药标准指征:转氨酶连续反复增高,HBVDNA阳性停药标准:1、干扰素:疗程相对固定;2、核苷类:疗程不固定注意:HBeAg阳性和HBeAg阴性患者疗程和停药标准不一样。停药后必需亲密观察。4．坚持诊疗中随访监测在诊疗过程中要定时监测ALT和血清HBVDNA,最好每3个月(12周)随访一次。假如立刻发觉HBVDNA升高和肝功效异常,立刻处理完全能够避免病毒变异对病人健康影响。假如在诊疗中出现病毒反弹要考虑到可能有耐药发生,应予对应检测、调整改疗。5．考虑联合诊疗或剂量加倍方案在HIV感染诊疗中,“鸡尾酒”疗法(三种抗病