第五章分子生物学法上

第五章分子生物学基本研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。重组DNA技术发展史上的重大事件（三大成就）：一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者（即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题）；二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。5.1基因操作的基本工具5.2DNA操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆（clone）技术5.6蛋白质与蛋白质组学技术（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端（不是整齐地切开，即在两条链上的切开位点不对称）的小片段。5.1基因操作的基本工具图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切位点（二）基因克隆的载体基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子。在此基础上,将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子,此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节:

目的基因和载体的获得;

目的基因与载体连接,形成重组分子;

重组DNA分子导入宿主细胞;

含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增；

基因克隆又称为DNA重组技术,DNA克隆或分子克隆。基因克隆载体的三要素：自我复制能力；携带外源基因片段大小；插入位点多少；易于鉴定识别程度。大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。

大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制（在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，一般只有1—2个/每染色体。）的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量很低。2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。3、穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。5.2.1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。5.2DNA操作技术一种集分子坟被放洪置到夕电场饥中，朵它就夜会以超一定题的速题度移州向适辣当的搬电极忙。我汤们把博这种逢电泳卡分子令在电南场作诵用下搬的迁沈移速季度，况叫做捞电泳滔的迁移浊率，它与革电场爪强度工和电葛泳分纤子本浓身所量携带您的净即电荷槽数成峡正比析，与骑片段阅大小胳成反悄比。生理变条件猎下，芝核酸蚁分子致中的刻磷酸仗基团溪呈离牺子化跑状态宏，所鼠以，DN衫A和RN谦A又被设称为校多聚砖阴离要子（po扛ly练an疲io役ns），在电暴场中向正论电极爽的方息向迁垒移。由于根糖-磷酸喘骨架惰在结以构上洽的重景复性狭质，板相同喷数量李的双体链DN烟A几乎示具有妥等量斯的净纪电荷权，因纠此它过们能以同乡丰样的惧速度跃向正咸电极雁方向曲迁移。琼脂购糖凝早胶分倍辨DN锄A片段堵的范洞围为0.晕2~毁50锅kb之间酷。聚丙勤烯酰材胺凝选胶的敢分辨选范围馋为1到10粉00个碱尤基对恐之间和。凝胶煎浓度顶的高才低影派响凝授胶介奸质孔沟隙的丝式大小丸，浓讯度越栗高，持孔隙岭越小奴，其愁分辨冷能力直就越启强。琼脂滑糖及泡聚丙润烯酰厅胺凝重胶分蚊辨DN惹A片段宫的能背力凝胶桨类型属及浓嫩度根分离DN孕A的大据小范峡围（bp）0.抗3%琼脂牙糖50甘0长00乞~1悉0勿000.携7%琼脂视糖20裳0罪00霸~1演0胜001.使4%琼脂伸糖6叛00黑0~缺30烟04.芳0%聚丙视烯酰托胺1腾00美0~鲁10给010岸.0火%聚丙畏烯酰扁胺50肿0~林2520愁.0缺%聚丙境烯酰邀胺50琴~1溴化右乙锭河染料农的化大学结朗构及悦其对DN袖A分子堪的插刑入作宗用。由于胞插入棉了溴竿化乙蛾锭分济子，露在紫舌外光舒照射俗下，袭琼脂棕糖凝粘胶电雾泳中DN杏A的条倚带便弊呈现笼出橘引黄色挣荧光箩，易辨于鉴欣定。袄（溴化么乙锭渣是高明度灵还敏的姻荧光示染色缴剂，具有爽高致渐癌性!普通著浅黄降色乳责胶手给套不幻玉能很蚂好的甲阻挡些，最执好用瓣蓝色聪实验肥用手牙套。桃）DN划A脉冲餐电场篮凝胶温电泳丝式（PF色GE寨pu种ls误ed善-f宝ie飞ld底g登el胃e汇le症ct兆ro纷ph荣or茂es帮is）示意间图在脉灾冲电趋场中烛，DN毕A分子尖的迁才移方枝向随镰着电被场方叨向的爹周期句性变伶化而耕不断堪改变深。在谈标准塑的PF糊GE中，拍第一侦个脉唐冲的渔电场弟方向裹在另稿一侧忠成45缩慧°夹角盖。由预于琼输脂糖挣凝胶堪的电贺场方等向、冶电流嘱大小难及作吐用时裹间都胀在交课替变蹄化，探使得DN掌A分子绩能够孙随时敲调整狗其游薯动方勇向，滋以适升应凝抵胶孔救隙的考无规耳则变鬼化。5.赠2嫂.边2细菌炸转化聚与目亲标DN链A分子赵的增旅殖通过舒细菌螺转化勇方法宗将体品外构联建好应的杂私种DN彻A分子让导入主宿主供细胞稿中。趣外源DN吉A通过悄自身杂载体片上的参复制奶起始垒点进秒行复乓制增矛殖，坛能在娇宿主绿细胞回中长井期保先存下鹿来，飘并能戚以完耐整的报形式繁从细琴胞中脖被分起离纯后化出栋来。细菌纠转化（tr齐an塑sf呢or肝ma秀ti帖on），是指技一种界细菌软菌株帮由于愁捕获悉了来泊自供售体菌之株的DN怒A而导岭致性妄状特跟征发逃生遗探传改锯变的磁过程奥。提供奇转化DN争A的菌颈株叫垒作供体乳菌株，接防受转修化DN坏A的细热菌菌天株则像被称葵为受体军菌株。细菌稍转化庸及蓝冷白斑已筛选为提消高效肺率，绘可对抖受体渣菌进蚂行物违理或良化学站处理虽，增沉加其端获取DN枪A的能悠力。晴经过妖这种你处理授的细安胞被员称作撒感受习态细墓胞（co写mp波et妖en回t以ce希ll予s）。蓝白阳斑筛馅选原理晶图两种苍增强疤转化跌的处肠理方枪法：①Ca庆Cl2法将快买速生乒长期差大肠扫杆菌未置于青经0℃预处汪理的勉低渗Ca狡Cl2溶液书中，荐细胞浸膨胀传，膜蕉通透农性改爷变，扇易与倘外源DN朽A相粘去附。将该穗体系疑转移闻到42路℃下做尊短暂洋的热化刺激叙，外役源DN佩A就可彻能被廉细胞笔吸收蔽。将榜经过斑转化猴后的绣细胞辆置于环选择爹性培恶养基豆上，赏筛选罗阳性咳克隆袖。转化凉效率迷可达随到5×台106~2寻×1采07个转化繁子/µ测g超螺听旋质珠粒DN蜻A（转化残后的愁受体瓶菌称搁为转掠化子tr驴an给sf狂or息ma奋nt）。②断电击雪法电脉俯冲（电峰场强港度、句方向态或电窗流的价周期掘性变侵化）候可以坛在细泛胞膜城上造赛成小表凹陷珠，形国成疏杂水孔台洞。园随着霜跨膜蒸电压股增加救，大次疏水远性孔懂洞会镜转变责为亲对水性脚孔洞穴，介蜘质中流的DN密A易于德进入催细胞伙质。电脉垂冲处示理的艳具体索方法励：将生弹长至姨对数稻中期武的E.腐c脾ol狂i菌液六冷却加至4℃后离盗心，比洗菌润后用10想%的甘针油悬演浮，你将高愧密度痰菌液访（~2拾×1摸010/m庭l）置于线特制飘的电羊极杯弹中进葛行电父击。获得缝最大叔转化坚效率木时场狡强一忍般为12酷.5孕~1秃5k披V/姑cm，时间减跨度妥一般旋为4.惭5~超5.同5毫秒。电击依转化饱与温疯度有榜关，钟一般盘在0~予4℃进行阶。由塑于转结化载裤体上俭常带才有La进cZ基因篮（大肠血杆菌茅乳糖朵操纵亭子中欧的一烤个基膛因），多廊用带碎有不述同抗模生素碌（常除用的柱抗生练素包群括氨容苄青弦霉素陪、卡涌那霉裙素和轻四环备素等精）的见选择伸性培补养基衣结合贷蓝白绝斑筛扣选法绘鉴定群转化邀细胞牺。5.伤2岗.赵3聚合型酶链逮式反挺应（PC险R）技术聚合砍酶链犯式反喝应是退快速揉扩增DN加A序列拾最常拥用的洋方法蝇。PC埋R反应扰的模粗板DN句A若是烦基因俗组上腔的某康个片邪段，栽就称特为ge控no暗mi酸c鹅PC祥R，若是mR可NA反转斤录产轨生的cD化NA，就称突为RT马-P润CR。PC棕R技术经的原伴理：首先荐将双茶链DN邪A分子谁在临江近沸绣点的筛温度贤下加裹热分糟离成纹两条期单链DN底A分子搅，DN众A聚合载酶以震单链DN纳A为模但板并概利用班反应冰混合垦物中迅的四港种脱累氧核庙苷三天磷酸俩合成巷新生疼的DN艺A互补贩链。步骤谁（三舞步）滩：DN申A解链翠（变地性）引物饿与模她板DN恒A相结柱合（价退火桥）DN嗓A合成哨（链样的延冈伸）经不口断重跃复循裤环之容后，欣反应计混合松物中算所含鞠有的田双链DN听A分子辉数（积两条劳引物昂结合才位点运之间陪的DN乘A区段嫂的拷过贝数苏），愈理论另上的崖最高清值应仅是2n,实得1.炒8n（n：循请环次躁数）省。聚合禁酶链曲式反围应（PC量R）技术PC故R指数舍扩增稿时循轮环次津数与DN武A产物减数量净的比笼较DN鹊A解链梁（PC纲R的第吨一步眼）：梅高温得处理将含维有待砌扩增DN京A样品点的反秧应混鹅合物物放置盗在高钓温（>9笼4℃）环瓣境下掘加热1分钟另，使净双链DN骗A变性谎，形夺成单剑链模雅板DN努A。94找℃加热挖，淬博火引物诞与模栽板DN扫A相结效合（第粗二步轿）：翁退火降低骑反应夏温度志（退陵火，施约50岩℃），诞约1分钟胡，使白寡核铺苷酸箭引物窃与两蝴条单涝链模租板DN伞A结合烂在靶DN贴A区段顾两端挪的互储补序送列位印置上支。50热℃~挤60胜℃，退床火引物行与模碌板DN叨A相结暮合DN觉A合成序（第疾三步谎）：将反考应混窗合物付的温挤度上敞升到72℃左右在保温1-数分柱钟，慰在DN唐A聚合土酶的盗作用脂下，龟从引未物的3'才-端加冬入脱兄氧核杆苷三敌磷酸民，并选沿着粥模板世分子帽按5'侄→3东'方向叹延伸强，合疾成新袄生DN凳A互补嗓链。PC婚R扩增联，72灯℃左右,按每分钟10洪00个碱授基对刊设计循环城往复常规PC莫R技术少能扩霉增两辜引物忧之间眉的DN黑A区段折，然捐而，姜有时夜我们纱也希殿望扩廊增位胃于靶DN羊A区段防之外较的未佩知DN田A序列遣，这粥就需仇要应未用反向PC砌R（re朽ve众rs流e饺PC吼R）技术。先用僚一种冲在靶DN于A区段壮上没虏有识镰别位艳点的剪核酸边限制尾内切其酶，仰从距珍靶DN傻A区段五有一振定距肥离的娇两侧唉位置搂切割DN妥A分子束，然乓后将窄这些摸片段伴作分子悔内连辱接成环胁形。查根据漫已知让的靶DN板A序列狼按向外厚延伸的要牵求设铺计一投对向絮外引淡物，律保证漠被扩材增的待是位饭于靶DN洽A区段形两侧醉的未输知DN透A序列委。反向PC根R的基晒本操海作程尝序。波纹弯线表姨示靶DN狠A区段粉，箭仗头表扔示限德制性宇内切困酶位犁点，渐分别针用方筒框表吩示靶DN取A区段她的左绵侧和致右侧负序列辞。用一惰种在确靶序咏列上自没有雁酶切桌位点针的核没酸限肿制性年内切忠酶消慰化DN亦A；产生锡大小勇不同持的线姜性DN仪A片段项群体风，其筑中靶DN抽A区段妇的DN教A分子旷长度滔不超吧过2~磁3k援b，经连暴接后养重新检环化仿；按靶巧序列枣设计杠的一酱对引另物与隙互补激序列吸退火特结合膏，其斧延伸律方向币如箭悄头所劳指；经PC烂R扩增枝产生毙的主缘瑞要是叹线性颤双链DN稻A分子刑，它麻是由威左侧设序列霜和右签侧序混列首舞尾连体接而肥成，枣其接葱点是勿所用蛋限制菌性内假切酶迷的识鼻别位湾点。5.邻2岔.狱4实时念定量PC过R（re更al写t涌im袍e桑qu苹an斯ti笑ta蓬ti公ve陈P诞CR，Q-回PC彻R）由于PC园R敏感器性高样（在几铁个小饶时内鼓将特顽异的企一段DN消A序列覆扩增歌到数逐百万除倍以戒上），拴扩增混产物丈总量硬变异括系数磨大，扔定量阴不准贷确。90年代败末期虹出现志了Q-PC密R，利啦用荧拿光检坏测PC渣R仪绘省制DN贡A扩增腹过程歼中的奖累积戴速率天动态融变化弄图，顾基本乔消除泼在测术定终佳端产土物丰袋度时义变异巡寿系数逼较大丽的问决题。混合给在PC孩R反应花液中悦的荧望光探竞针只询有与盖大片季段DN谁A结合涛后，电才能穗够被镜激发执出荧晋光。随着掌新合映成DN控A片段每的增苦加，把由于顾结合脉到DN稼A上的倡荧光仪探针凯增加总，被痒激发炮产生控的荧向光相拔应增遍加。非序面列特杨异性描荧光孙染料SY虽BR夸G传re清en鸟I疗,激发外光波阿长52哑0n背m。SY控BR甲G者re暑en贺I作探春针的铸实时触定量PC报R实验拴过程园示意您图（奔荧光绢强度撇反映PC劣R产物震的量讯）Ha仔n机P.澡,带Li逝Q妇.,要a仰nd游Z生hu欧Y影.X田.相(2址00取8)稳T运he循P肝la贸nt鱼C振el姻l唯20声:1毫48莲2-坚14号93壶.（野牵生型删拟南说芥）（野枯生型抬拟南谷芥的临突变题体）P1围69为确允保荧甩光检畅测的灰确实淋是靶DN脊A，又设塞计了制仅能与目利的DN滋A特异扎结合滨的荧灾光探励针。Ta雨qM扶an探针宴是一每段与滤靶DN拆A序列楼中间煮部位悬结合丑的单很链DN曾A，长50颜bp场-1基50筑bp，该DN链A的5’和3’端带着有短湾波长巨和长雾波长讨两个皮不同夹荧光熊基团流，由暂于彼恼此距盖离靠驳近，议在荧桂光共盆振能跟量转份移（FR帜ET）作用市下发旱生荧挠光淬斧灭，选因而漠检测哲不到傍荧光引。随着PC敌R反应穿的进舌行，Ta倚qM份an探针漆结合俭到目闭的DN坝A序列提上，偿并且剥会被战具有摧外切便酶活寸性的Ta暮q五DN导A聚合橡酶逐震个切君除而酬降解讯。切巧下来高的荧削光基样团解掠除了徒荧光尾淬灭嚼的束考缚，旗会在限激发阁光下乳发出棕荧光载，因区此，要产生袍的荧篮光强我度直哲接反贡映了刑所扩膏增靶DN涂A的总烟量。Ta粪qM侵an探针浇实时标定量PC笑R技术Ta习qM子an探针校具有异三个敲要素辩。（静见P1漏68）在此杂状态恰下两啦个荧境光基皂团十蚊分接换近，竭不发食荧光冷。Ct值是携产物果荧光窜强度代首次头超过或设定气阈值意时，PC威R反应疤所需概的循储环数蜜。利邪用标台准曲她线，碧可以颂确定蝇样品时中待煌检测护靶DN抓A的绝徐对含灰量。用实过时定构量PC琴R法分尊析未监知样糟品靶叛基因四的绝蹲对表卧达量涝。（P1渔69）5.歇2紧.匠5基因驴组DN叨A文库变构建把某皮种生摔物的漏基因编组DN离A切成锅适当考大小电，分慨别与搅载体哨组合续，导利入微搂生物党细胞潜，形舅成克沙隆。那汇集测包含阀基因康组中束所有DN拣A序列训的克姨隆（荷理论蹲上每肌个序柔列至丘少有超一个旋代表亩），夸这样喜的克石隆片雷段的环总汇押，称旧为基设因组DN铺A文库大。Cl坦ar状k和Ca授rb雁on于19杯75年提凶出公群式：N=讯ln月(1年-p辛)凑/冻ln戴(1歉-f仗)式中曲：N表示浴一个野基因齿组文踏库所夜应该量包含碗的重水组克倡隆数拴目；p表示邀所期责望的稳靶基积因在蒜文库先中出撤现的域概率缸；f表示今重组原克隆描平均鹊插入贵片段胆的长殃度与签基因投组DN胸A总长凯的比说值。为获颠得整资个基凶因簇似或一液个基按因及雾其两搅翼延概伸序序列，猫基因爸组文舟库中番的DN扔A片段火常大布于20泄kb。以人桃为例向，其伤基因订组大善小为3×好109bp若p=批99盒%，平均贪插入丹片段截大小稼为20产kb，则N=引6.峡9×某105。构建姻基因河组文哭库最陆常用很的是λ噬菌纹体载悟体（磁克隆泽能力母约15记—2您0k趴b）和限亦制性纷内切寇酶部江分消意化法贴。例许如用江识别4个核免苷酸泉的核胶酸限朗制性息内切付酶Sa妥u3吃A，与Ba辱mH吨I是一纪对同关尾酶沫消化DN倾A，由Sa从u3嚼A酶切哭产生另的DN梯A片段忙可插蜜入到裙经Ba拼mH远I消化知的λ噬菌抽体载戒体上搞。用Sa暂u3剖A限制差性核片酸内均切酶雅消化瓶真核朽生物干基因通组DN栗A并利略用噬菌恢体载季体构驼建基刮因组蜘文库疏的过关程图缘瑞示。λ噬菌炭体作虹为克乒隆载每体此外概，还搅有很甩多大陈容量榴克隆炊载体豆，如仙柯斯田质粒翼、细捧菌人继工染烤色体询（BA肝C）、P1源人筛工染罩色体冤（PA怜C）、酵母慎人工搞染色覆体（YA木C）等都僻可用阴于基目因组唱文库踢的构菠建。它们俯的优抢点是即可以疲插入啊更大萍片段DN阀A，但是遵稳定腊性一呢般较笔差，败在大奔量复辩制的葱过程丙中容尚易出干现缺摘失现安象。跪操作禁也相池对较逮困难副。5.放3厌R锡NA基本屿操作妖技术真核志生物星基因凯组DN萄A庞大矿，有摆大量紫重复秒序列泪，很混难直挣接分欢离得危到靶巩基因蒙片段锦。而cD斯NA来自必反转猪录的mR躬NA，无冗捧余序登列，云通过袍筛选cD愚NA文库胃，可粱较快马地分讽离到泄相关汪基因须。细胞跌中的量总RN项A包括mR概NA，rR估NA，tR党NA以及层一些芦小RN怕A（sR次NA）。一个汽典型布的动漏物细显胞约堂含10-5μg罩R丽NA，其拉中：80变%-袜85狱%为rR应NA15搬%-妥20坚%为tR轰NA及sR崭NAmR明NA约占即总RN闹A的1%府-5孩%rR沉NA分子头具有理确定戚的大糟小和鲁核苷熄酸序捞列，男特别腐是28藏S和18笨S特征营性条后带是推电泳笨鉴定贩总RN银A纯度协和完砍整性食的重绘要参智数。Li己Q享e缩慧t排al掌.准(2棚00络6)迈J膏.筝In善te析gr丽.疗Pl贝an坑t抚Bi帽ol昼.颠48谱:奸11阀4-柴12添0.图5-惭14嚼P惧ol兵yA缓Tt挎ra保ct置m送RN求A的分骑离纯梦化过家程简减图。RN陶A的浓汗度和活纯度君可以郊通过蛋测定萌其OD26转0和OD28晒0来判浅断。OD26训0为1时相雅当于竹浓度产为40赢μg佳/m筝l，而OD26窗0/O映D28孝0的比瘦值如百果在1.月8-忌2.份0之间旨，表捞示所虚提取膜的RN真A纯度敲较好蛛，如销果样鸽品中颜有蛋邻白质劣或酚律污染窃，则OD26来0/使OD28华0的比宣值将存明显窄低于1.绑8。由于RN洪A分子维敏感睛脆弱偿，在鸽自然金状态棵下难叫以被叮扩增践，为猎了研滑究mR区NA所包福含的己功能尺基因罪信息石，一聚般将争其反筐转录袭成稳烂定的DN尤A双螺犁旋（cD月NA，co舌mp菜le绵me闲nt位ar店y求DN涨A），再插煤入到隔可以冶自我缸复制俱的载肠体中筑。图5-句15厚c确DN柴A合成仆过程朴示意苍图。图5-更16定向cD制NA合成凉及分着子修按饰因为雷绝大跃多数殃大肠将杆菌恢细胞蚕都会项切除副带有5'逼-甲基担胞嘧阴啶的阔外源DN赖A，所以走实验英中常句选用mc舍rA-mc永rB-菌株聪以防纤止cD格NA被降艘解。cD介NA文库刑的构眨建cD色NA的长岸度一遮般在0.农5-拜8季kb之间支，质挺粒载们体和诊噬菌舅体类漫载体灶都能木满足骂要求外。cD身NA文库裤常用Un汪i-刊za情p黎XR（一种λ噬菌肾粒载和体）双做载稻体，联它具吹备噬咽菌体绵的高复效性贿和质次粒载速体系司统利欲用蓝窄白斑烤筛选书的便组利，耻可容助纳0-真10概k选b佩DN防A插入苹片段杏，含诱有pB殃lu键es宅cr分ip目t载体维的全总部序惰列。重组昌后可鞋通过粗体内地剪切轿反应卧（In迟V贡iv枕o涂Ex谊ci叔si但on）将cD梳NA插入休片段峰转移陕到质忽粒系妇统中旨进行混筛选掏、克晃隆和哈序列食分析钻。基因袋文库胁的筛烧选基因晚文库脆的筛框选是馆指通爬过某裂种特示殊方够法从盼基因逼文库旬中鉴呜定出趟含有骄所需呆重组DN廊A分子亦的特其定克纯隆的拿过程堂。筛装选的老方法蝴有很倾多种娱，如兽核酸费杂交霜法，PC撑R筛选睬法和该免疫寒筛选舍法等赴。1、核旁酸杂滑交法皇：核酸赴杂交生法以膜其广灯泛的映适用美性和筒快速领性成路为基晋因文丢库筛淡选中例最常魔用的碍一种讯方法呆，用摧放射严性标章记的峰特异DN欢A探针制适用贼于高患密度简的菌余落杂锡交筛粗选。将待仰筛选昆菌落梢转移蛇到硝恶酸纤罚维素准膜上掩，适屯当温彻育。擦同时驾保留很原来针的菌瓣落平产板作则对照轮。取出回已经念长有涛菌落杜的膜倾，用够碱液雅处理滋，使拆菌落主发生沃裂解美，DN跳A随之马变性副。用肠蛋白哭酶K处理矮硝酸础纤维条素膜趣去除塔蛋白个质，惧形成恩菌落DN乎A的印诉迹。80佣℃烘烤偏滤膜嗓，将DN暂A固定鸡在膜梅上。优将滤捕膜与随放射坐性标贫记的DN扛A或RN候A探针棉杂交标，通段过放港射性暖自显演影显盾示杂吵交结谷果。各通过兴对应能于平孕板上贿的位热置找腹到相缎应克素隆。图5-歪17通过袜核酸协杂交府筛选惑目的今克隆求流程林图2、PC王R筛选粥法将整助个文廊库（垄以质稻粒的纤形式凑或者丈细菌致的形狸式均挨可）蓬保存胸在多孔被培养顽板上，用窑设计瓣好的轻目的明基因姜探针绣对每瞧个孔继进行PC猛R筛选轿，鉴答定出五阳性常的孔泰，把抢每个盈阳性肝孔中骑的克颜隆再载稀释油到次识级多纹孔板就中进鸦行PC质R筛选耽。重吴复以越上程悦序，滨直到柱鉴定召出与绸目的越基因声对应户的单私个克面隆为撞止。3、免悲疫筛挑选法该法捕仅适侵用于哨对表驻达文粱库的鸡筛选桃。若虚实验番中靶涌基因安的序骗列完垃全未带知但亏是有盟针对票该基怕因产样物的磨特异款性抗扮体，诉就可仪以采刻用免浆疫筛椅选法锣。图5-子18噬菌狮体表驰达文居库的顾免疫感化学否筛选蚀法示夜意图5.叶4碗S泽NP的理愤论与钻应用SN叫P是Si凑ng坚le眨N披uc仆le贤ot迎id耳e桂Po然ly鸣mo猴rp渔hi穗sm的缩毅写，讲即单核紧苷酸体多态酿性，指萌基因兽组DN漆A序列茧中由糖于单爽个核差苷酸晌（A，T，C和G）的突奔变而伟引起泼的多勺态性战。SN蚁P所表伸现的扇多态适性只侮涉及幸到单妙个碱际基的笋变异干，这错种变在异可乞由单笔个碱矮基的汤转换(t廉ra支ns晴it只io雪n)或颠聚换(tr坡an帝sv毯er服si萝on)所引森起，循也可耗由碱拖基的黄插入川或缺往失所个致。碍但通窜常所厦说的SN斤P并不拾包括很后两踏种情怎况。5.择4太.皇1搭S椅NP概述科学零上把逝染色涨体DN功A同一吊位置毫上的遥每个轮碱基奸类型辆叫做恳一个蚊等位享位点路。SN洞P是基封因组况中最橡简单尝最常道见的施多态的性形题式，盘具有泼很高君的遗愉传稳叨定性强。SN梅P检测港和分甘析技掏术已变经成骆为继饱限制舅性片期段长滑度多说态性贫（RF兔LP）和微讯卫星车标记撤（SS纵R）之后勤的第鹊三代拆遗传适标记条。染色公体上映共同捧遗传袍的SN哈P组合图中SN恭P1和SN临P2在同返一条膏染色击体上贼而且东距离究很近趣，SN占P1有等谦位位她点A和G，SN尤P2有等缎位位难点G和T。因此军，染晕色体引对有标两种广可能毕的SN木P组合恋。单倍型基因型外显子IV内含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米gl室ob幅ul谁in聋1不同病单倍斜型和称基因满型之济间的惩多态奸性比震较据估洋计，暖人类DN赤A中每30稳0-喂10厌00个碱蔽基对垄就有呀一个SN厉P，因此缺，一右个人借类个倾体大歌约携府带30劲0万-1衰00纱0万个SN湖Ps。位于鸣染色雨体上累某一各区域涉的一龄组相紧关联棵的SN近P等位回位点普被称撕作单很倍型奴（ha慎pl吊ot触yp坑e），相邻SN视Ps的等证位位细点倾拣向于板以一镰个整势体遗臣传给科后代归。根据SN但P在基难因组博中的泄分布祸位置粮分为根编码共区SN银P（cS坦NP），调控倦区SN彼P（pS于NP）和非办编码列区SN启P（rS校NP）三类哭。编码智区内融的变营异率仆仅占哄周围柿序列被的1/否5，cS提NP的总费量显彻著少驰于其砍它两纠类SN假Ps。cS使NP分为抢同义cS怪NP（sy挎no技ny担mo很us油c齿SN聋P），编码坝序列仙的改熊变不默影响枪所翻执译的遇氨基宿酸序加列）胀和非逐同义cS寨NP（no舌n-山sy领no滔ny浸mo犯us矿c咐SN巷P），碱基厨序列肆的改俊变使妥氨基隆酸序曲列发鲁生改哨变，肿可能南影响蝇蛋白矛质的滑功能葡。5.魂4窜.衬2啦S爹NP的检兆测技岔术通过DN强A测序支法获报得新以的SN都P。基因垂分型内（ge测no碰ty偶pi聋ng）是指甲利用另数据炉库中过已有横的SN狼P进行网特定欠人群波的序疾列和喘发生远频率健的研若究，锈主要恼包括研基因柿芯片径技术纹、Ta房诚qm豪an技术纺、分阶子信圾标（mo悠le懂cu咬la义r星be片ac竟on除s）技术辛和焦半磷酸宇测序祝法（py删ro宿se切qu政en迅ci记ng）等。1．基牢因芯娃片技瞎术通过爱优化幸芯片行杂交档程序急，使动探针课只与蚁完全信互补沟的序赌列杂赠交而甜不与炭含有伪单个贱错配导碱基快的序貌列杂叔交。优点弄是高脾通量竖，一传次可究对多劝个SN掀P进行酬规模彩性筛犯选，沿被检蔽起始讯材料腊也很擦少，摘操作范步骤巧简单絮。缺点魔是芯完片设班计成躺本高昌。而活且，傅由于DN土A样品交的复越杂性挨，有目些SN倡P不能浙被检宁测。2．Ta制qm吼an技术PC抢R反应彻系统泼中加晌入2种不盆同荧抽光标啄记的李分别荐与两辛个等基位基泥因配诸对的挑探针考。随棵着PC怎R的进扇行，桌与模兽板完戴全配偏对的论探针累逐步荷被Ta京q枯DN昆A聚合忆酶的5’骨→3体’外切怕活性吓所切伤割，格荧光仅基团爽与3’端的捡淬灭孕基团窗分离兽，荧冶光基葵团被嚷激活倾。不摸完全内配对饲的探驼针（绪代表等另一同种等凯位基朴因）国不能搭被有演效切砌割，彼供体然荧光心基团霸依然假被淬明灭。3．分围子信主标（mo回le处cu缩慧la撞r诵be坦ac扮on）技术是一肾种呈邪茎环据结构遇的荧造光标跪记的意寡核架苷酸赢，环咏状区脊与靶秩序列傻特异睛性结矿合，诸茎干龟区由5-侵8个碱打基对萝组成云，5’端带轰有荧屑光发脆生基西团，3’端带膊有荧证光淬魄灭基感团。寺自由肤状态童时，吐分子燃信标惊呈发省卡式扫结构医，荧狼光几铅乎完坊全淬絮灭。务与靶旬分子惑相结虑合时毛，荧慌光基局团和趟淬灭培基团奖之间桌的距捞离增简大，瞎分子稼信标疯的荧努光恢掏复。Ta陪qm泽an技术掏（上紫）及曲分子胀信标给技术吉（下佩）原世理示粘意图鞋。在多劳细胞具的高六等生绞物个蝇体水围平上舌，克榆隆表傍示由锄具有妹相同院基因衫型的宣同一仅物种终的两附个或口数个去个体正组成宰的群范体。僻从同北一受摊精卵择分裂轰而来触的单驾卵双链生子抹（mo栋no友zy拼go次ti圾c伴tw遵in毅s）便是因属于戏同一滋克隆仿。5.续5基因灾克隆哈（cl拳on对e）技誓术在细灰胞水甩平上谱，克缓隆一秧词是雾指由盛同一末个祖猫细胞泼（pr紧og秃en它it纽奉or元c挽el蜓l）分裂时而来赛的一参群带宽有完仅全相歉同遗聚传物苏质的酒子细库胞。在分榜子生岂物学虫上，居人们两把将丙外源DN浪A插入府具有摘复制娃能力资的载怠体DN捧A中，恋使之兆得以容永久委保存犬和复溪制这悠种过诱程称钢为克灶隆。5.毯5序.肺1膨RA忙CE技术(r沉ap倒id森a受mp年li望fi喂ca贼ti检on萄o慎fcD孔NAen伏ds农)是由Fr糟oh榴ma仓n等(1衰98瞒8)发明绩的一必项技伶术。羡是通漏过PC翁R进行cD真NA末端葬快速席克隆付的技上术，叫无须脆建立cD败NA文库膀，可缎以在丹很短嫂的时天间内千获得阳有利革用价什值的棋信息压。RA剖CE是基东于PC亮R技术就基础丛上由嫩已知制的一垄段cD端NA片段故，通役过往于两端车延伸咽扩增懂从而辱获得谋完整董的3'端和5'端的较方法虏。一般创分5’犬R泻AC意E和3’告RA尚CE两种绒：3-柄RA报CE较简补单，袖首先疗将mR旦NA或总RN冤A用Po腿ly像T引物反转蹲录，维根据锹一般扁基因等具有po戚ly冈A尾巴皂的特总点，午选用芬特异则引物(根据盆已知蝴序列夜设计)和Po段ly但T引物PC妖R即可弓。5-闯RA养CE相对绪较难摄，目编前流爷行几病种5-满RA惧CE。其钱一为携加接令头(传统)，根仿据接四头引身物和迅自己驾设计庙特异戏引物PC坦R，可兽以设页计巢厉式PC循R二次柴扩增册。另颗外，萝有利摇用反箱向PC扔R技术暖，连刻接成级环再PC只R。巢式PC昂R（ne去st鲜P奖CR）：是指宵利用厚两套PC焦R引物张（巢节式引旋物）照进行评两轮PC呢R扩增性反应亮。巡寿在第照一轮牧扩增薯中，外引咬物用以柏产生戒扩增铺产物臂，此虽产物震在内引竿物的存辅在下创进行逃第二图轮扩水增。泛由炉于巢帖式PC型R反应行有两拣次PC晃R扩增霸，从浙而降糊低了动扩增臣多个阻靶位绸点的秒可能确性（管因为歌与两彻套引属物都服互补萍的引毯物很竞少）蜂增加阵了检龄测的饮敏感散性；怎又有耀两对PC华R引物肌与检刑测模盐板的筋配对雄，增复加了蓬检测币的可岔靠性屑。院一般幼应用峡于动杯物方坦面。腹如：蜘病毒情，梅淘毒螺汇旋体套，HI琴V，肿骂瘤基犯因等所。5’锦R甲AC鼠E3’晒R甚AC允E利用mR岛NA的3‘末端熄的po浅ly（A）尾次巴作华为一喷个引简物结邀合位抬点，宽以连拳有SM暑AR俱T寡核斧苷酸助序列雁通用邻接头烦引物圈的Ol鸡ig浇o（dT）作溉为锁黑定引哪物反探转录颤合成努标准炒第一香链cD枪NA；再将用RN骄as禽e水解租模板诞链；领然后叮用一土个基归因特侮异引凯物GS饮P作为锅上游阵引物辈，用查一个兔含有轰部分消接头惨序列址的通都用引倚物UP述M（un习iv珠er琴sa富l旧pr向im恨er）作厨为下萌游引尊物，表以cD勤NA第一益链为协模板找，进脸行PC周R循环权，把附目的浊基因3'末端蚂的DN倘A片段糟扩增雄出来努。RA黑CE的另冲一种铅代表跪方法碎是自年我连截接法辟（Se施lf锻-Li仓ga车ti嘴onme教th风od）1、反缎转录助（RT）反骡应2、Hy培br螺id忙R召NA的分昂解3、单热链cD绸NA的自畜身连鸭接4、PC件R扩增5‘未知仿区域5、目锤的DN鹅A片段斤的切惧割回薄收6、DN飘A序列钓测定5.傻5愈.励2cD盘NA差示庭分析蕉法(R友DA举,咏Re伪pr荷es透en邪ta畅ti凯on测D昆if量fe削re终nc租e猫An如al戚ys白is填)充分舞发挥英了PC则R能以赤指数仁形式旋扩增逆双链DN边A模板的，而改仅以蹈线性魂形式模扩增摸单链并模板肺的特狗性，蚁通过探降低cD略NA群体戚复杂摔性和文更换cD盲NA两端良接头艇等方填法，左特异船性扩干增目糠的基答因片现段。PC昏R产物喉的特披异性喂和所蝇得的cD扔NA片段链纯度秤均高。因为Te精st隙er和Dr侮iv健er在接愤受差冈示分底析前角均经让一个4碱基报切割教酶处凳理，咽形成定平均旱长度25上6b颜p的代爪表群，保证搬绝大感部分患遗传粘信息坛能被坊扩增吹。5.侄5烧.某3败Ga吓te烤wa宿y大规钥模克正隆技口术Ga杰te仔wa骑y技术切利用λ噬菌蹦体进劝行位蓝点特预异性DN窗A片段佣重组罗，实免现了饭不需简要传昏统的遮酶切杂联接姓过程茄的基参因快恰速克薯隆和负载体堤间平量行转吨移。Ga普te御wa触y大规奋模克运隆策驼略TO毕PO反应:将目阶的基局因PC破R产物匆连入En勺tr吊y载体霞。载正体上赛的CC乖CT倘T被拓依扑异垒构酶张所识想别，喜通过嗓与切币口处畏的磷晕酸基苏团形厘成共解价键引，将索该酶洋偶联交在载鞭体上值。5’换GT让GG粘性箱末端讨攻击PC缺R产物穿的互隶补性咳末端训并与学接头誓序列CA府CC退火匹，使PC席R产物胁以正欠确方届向连愿入En罪tr忌y载体旬。（典见图5-稿24短a闻P千18吉6）LR反应辽：将目勒的片爬段从En封tr茫y载体隔中重县组入春表达办载体达。En司tr洁y载体摊上基娇因两悔端具困有at胶tL县1和at愈tL秋2位点馆，目昌的载光体上徒含有at是tR惧1和at该tR降2位点汁，在兼重组她蛋白仁的作素用下浪发生胀定向舒重组缘瑞，形肢成新兼的位天点at耻tB尝1和at证tB赶2，将目攀的基虎因转罢移到判表达奔载体友中。岛（见聚图5-席24宜b漏P券18叹6）5.偷5傅.背4基因瘦的图朗位克锣隆法体（Ma渴p-约ba照se破d京cl迈on迎in存g）所有逢具有匀某种畅表现裤型的清基因赢都可邻以通机过该巡寿方法锄克隆期得到劫。通过病构建终遗传脏连锁摧图，缸将目辩的基帆因定瞧位到衡某个犯染色蛮体的缘瑞特定拍位点蠢，并界在其帅两侧揉确定丽紧密拢连锁肯的RF澡LP或RA秩PD分子先标记毙。通过屡对不鹅同的宣生态口型及蜡限制坏性内则切酶吩和杂榨交探嘴针的兆分析户，找禾出与妹目的踢基因控距离堆最近考的分亿子标永记，疗通过菌染色牺体步姓移法垂将位她于这雨两个义标记旺之间阶的基运因片东段克睡隆并您分离痰出来喉，根登据基第因功扭能互业作原似理鉴姓定目豆的基倦因。染色蚀体步搬移法证克隆先基因私示意虏图在RF辈LP作图拖中，谱连锁而距离深是根跟据重拥组率礼来计节算的兆，1c侍M（厘摩谋）相旦当于1%的重华组率型。人详类基分因组魄中，1c株M≈倘10总00乞kb；拟南短芥菜掩中，1c拢M≈锁29赌0k静b；小麦稀中，1c商M≈冠35要00铲kb。用图曾位克恰隆法字获得扔水稻开脆杆浩基因BC陡1将BC毅l定位含于水煎稻3号染众色体规（Ch脆r3）分子亏标记C5卸24僚a和RM关16之间证；B.覆盖BC欠l位点缝的BA挡C大片败段。C.狠B脊Cl位点怜的精脾细定生位。BC揭l位点苏被定膏位于详分子恐标记P2和P4之间取与P3共分川离。D.吊B高Cl基因锄结构拢。红干色为章编码饱区，预白色旷为5’和3’非翻相译区菌，黑困色线缩慧段为存内含轨子。bc津l-耳1和bc惠l-光2表示众两个晴突变帝位点瓜。Li赔,泪Y.雁,汤Qi续an扒,高Q.提,爱Zh乎ou凭,束Y.元,稀Ya色n,刻M婚.,菊S在un恼,袋L.胃,Zh成an甲g,激M缴.,秧F踪蝶u,取Z巾.,疑W岂an宗g,踪蝶Y杂.,鸭H必an津,庙B.兄,桌Pa甚ng惠,X.版,润Ch拥en撤,阔M.奥,搂an叠dLi栽,被J.(2冬00睬3)猾.务BR侧IT尺TL坟E班CU启LM记1,奶w墓hi骆ch坝e全nc独od涌es利a询C暮OB受RA够-l折ik晌e杏pr帽ot辫ei昂n,诵a判ff黄ec咏ts待t哭he朴m活ec悟ha朝ni慌ca绒l足pr缘瑞op减er欣ti黎es窃o巾f荡ri喊ce愈p傻la盟nt蹲s.Pl牌an桃t齐Ce煮ll15谎,询20箭20吸–2季03汽1.5.队6蛋白礼质与畅蛋白腊质组谣学技形术蛋白缝质组粘学是更蛋白呀质（pr纪ot扭ei杀n）和基老因组械（ge谈no戚me）研究习在形品式和芽内容锹两方率