细胞生物学 4第四次实验

第四次实验实验九植物细胞骨架的制片技术及形态观察实验十细胞有丝分裂标本的制备与形态观察实验九植物细胞骨架的制片技术及形态观察实验目的1.掌握光镜下细胞骨架的基本形态结构。

2.了解微丝的显示方法。细胞骨架细胞质骨架（cytoskeleton）指真核细胞中的蛋白纤维的网络结构。细胞质骨架包括微丝（microfilament）、微管（microtubule）和中间纤维（intemediatefilament）。微丝确定细胞表面特征，使细胞能够运动和收缩。微管确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导轨。中间纤维使细胞具有张力和抗剪切力。其它骨架成分：细胞核骨架、细胞膜骨架、细胞外基质。细胞核（紫色）与细胞骨架

细胞骨架是由微管蛋白（黄色）形成的微管和由肌动蛋白（蓝色）形成的微丝等组成。实验原理

用TritonX-100溶液处理细胞时，可使细胞质膜中和细胞质中的全部脂质和部分蛋白质被溶解抽提，但细胞骨架蛋白质不受破坏而被保存。经固定和考马斯亮兰（非特异性蛋白质染料）染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束（蓝色）。实验用品1.材料：洋葱2.药品：

0.2MpH7.3磷酸缓冲液（PB）

0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）：0.2MPB50ml加0.15M氯化钠50ml双蒸水定至1LM-缓冲液：50mM

咪唑，0.5mM

氯化镁，50mM

氯化钾，1mMEGTA[乙二醇-双-（2-氨基乙基醚）四乙酸]，0.1mMEDTA（乙二胺四乙酸），1mMDTT（二硫苏糖醇），4mM

甘油

1%TritonX-100（用M-缓冲液配制）

3%戊二醛（用0.01MPBS配制）

0.2%考马斯亮蓝R250（用少许无水乙醇溶解，然后用12.5%三氯醋酸定容，装瓶备用）3.用具：烧杯、剪刀、镊子、手术刀、滴管、称量瓶、显微镜、载玻片等实验方法1.用镊子撕取若干片洋葱鳞片的内表皮（不要用靠近鳞片边缘的表皮），剪成0.5×0.5cm大小，放入容器中，加入PBS，浸泡3min；2.吸去磷酸盐缓冲液，加入1%TritonX-100，处理30min（28℃恒温箱）。然后用M-缓冲液洗3～5次，每次5min；3.再加入3%戊二醛液，固定20min（28℃恒温箱）；然后用PBS洗3～5次，每次5min；4.然后用0.2%考马斯亮蓝染色20min（在载玻片上进行）；之后用PBS冲洗至水无色；5.制片，并观察实验结果。

取内表皮，置于载玻片上，加PBS浸2min

吸去PBS，加2~3滴1%TritonX-100，处理25min

吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗3次，每次2min

吸去M-缓冲液，加2~3滴3%戊二醛，固定15min

用PBS洗3次，每次2min

吸去PBS，加2~3滴0.2%考马斯亮蓝，染色15min

用PBS洗2次，每次2min，吸干，镜检细胞骨架标本观察作业在显微镜下截取细胞骨架的图片，并加以标注。原理有丝分裂是真核生物体细胞的基本增殖方式。通过DNA的复制，以及染色体的分裂，实现遗传物质平均分配到两个新的子细胞。实验十细胞有丝分裂标本的制备与形态观察有丝分裂的特点和意义

特点：染色体复制一次，细胞分裂一次，结果1个细胞变为

2

个细胞，且两个子细胞与母细胞遗传物质在质量上和数量上完全一致。

意义：保证了物种遗传的连续性和稳定性。

维持了个体的正常生长和发育。细胞有丝分裂为了便于描述人为地划分为六个时期：间期（interphase）；前期(prophase)；前中期(premetaphase);中期(metaphase)；后期(anaphase)；末期(telophase)。间期

包括G1期、S期和G2期。

G1期：

是从细胞分裂完成到DNA开始复制的时期，有大量RNA和蛋白质形成；S期：

是DNA进行复制阶段，DNA含量加倍；G2期：

合成与有丝分裂有关的物质。前期①染色质凝缩，②分裂极确立与纺锤体开始形成，③核仁解体，④核膜消失。前期开始的标志：第一个特征：染色质开始浓缩、凝集形成染色体。第二个特征：细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体开始装配。前期中期所有染色体排列到赤道板上，标志着细胞分裂已进入中期。后期2条姐妹染色体单体分开并移向两极。末期

从染色单体到达两极，至形成两个新细胞为止的时期。涉及子核的形成和胞质分裂两个方面。细胞有丝分裂周期植物细胞的细胞周期1.植物细胞的细胞周期与动物细胞的标准细胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四个时期。2.植物细胞不含中心体，但在细胞分裂时可以正常组装纺锤体。3.植物细胞以形成中板的形式进行胞质分裂。植物细胞有丝分裂实验用品1.材料洋葱根尖2.器材显微镜、解剖针、镊子、盖玻片、载玻片、培养皿等3.试剂

70%乙醇、45%醋酸、改良碱性品红染液实验方法1.取材：将洋葱置于盛有水的小烧杯上，使其鳞茎浸入水中，室温培养3～5d，每天换水。待其根尖长到2～3cm时，切取1cm左右的根尖。2.预处理：将根尖浸入蒸馏水中，放置冰箱（4℃）中处理24h。减缓细胞的有丝分裂，使处在分裂期的细胞数量增多，便于观察。也可用秋水仙素进行处理。3.固定：取出材料，放入卡诺氏固定液中固定3h左右。固定液用量约为材料体积的15倍以上，若固定不好，会影响以后的步骤。实验方法4.解离：将固定的根尖用清水漂洗几次，然后用1mol/L的HCl

在60℃处理30min左右。或用6mol/L的HCl

室温处理5～10min。5.染色和制片：将解离后的根尖用水漂洗3次，放在载玻片上，用镊子轻轻捣碎。用碱性品红染色5～10min后，用吸水纸吸去多余的染料，盖上盖玻片，用铅笔或橡皮头轻轻敲打，使细胞彼此离散。6.镜检：在显微镜下观察根尖细胞，如果细胞染色过深，可加上45%的醋酸（或95%乙醇），进行分色处理。分色时，一般是在盖玻片的一边滴加45%的醋酸，另一边用吸水纸吸去多余的液体。如果细胞重叠比较严重，可用橡皮头再次轻轻敲打，直至细胞在玻片上呈淡淡的云雾状为止。

注意：敲打时不要使细胞在玻片上发生扭动，而使细胞形态发生变化。根尖分区示意图

roottip.Examinethesquarecellsjustinsidetherootcap.Thisistherootmeristem(embryonictissue)wheremitosisisoccurring.Fartheruptherootistheelongationzone,wherecellsarelongrectangles;thesecellsarenotundergoingmitosis.显微观察低倍镜下