DB35T 1280-2012大豆疫霉菌分子检测技术规程

ICS65.020B16DB35福建省地方标准DB35/T1280—2012大豆疫霉菌分子检测技术规程StandardprotocolformoleculardetectionofPhytophthorasojae2012-11-02发布 2013-02-01实施福建省质量技术监督局发布福建省"地方标准

大豆疫霉菌分子检测技杰'杪程DB35/T1280—2012*2013年1月第一版2013年1月第一次印刷DB35/T1280DB35/T1280—2012IIIIDB35/T1280—2012DB35/T1280—2012II目次TOC\o"1-5"\h\z前言 III1 范围 12规范性引用文件 1术语和定义 1原理 15材料与试剂 15.1主要仪器与器材 11.1 PCR检测仪 15.1.2 凝胶成像仪 25.1.3 台式离心机 25.1.4 涡旋混匀器 25.1.5 电泳仪 25.2主要试剂 25.2.1苯酚；氯仿；异戊醇；乙醇 25.2.2 二甲基亚砚 25.2.3 氢氧化钠 25.2.4脱脂奶粉 22.5 PCR常规试剂 2采样 26.1采样工具 26.2样品采集 22.1大豆植株 22.2土壤 23样品贮运 - 26.4样品存放 2操作方法 ./.■ 21 样本DNA制备 21.1植物组织中病原菌DNA的提取 27. 1.2土壤中DNA的提取 31.3DNA的保存 37.2 检测 37. 2.1加样 37. 2.2PCR检测 37.2.2.1反应体系 37.2.2.2反应条件 37.2.3套式PCR检测 37.2.3.1套式PCR模板DNA制备 37.2.3.2套式PCR反应体系 37.2.3.3套式PCR反应条件 47.3 琼脂糖凝胶电泳 48结果判定 4PCR检测结果判定 4套式PCR结果判定 49样品处理 4附录A（资料性附录） 大豆疫霉菌样本检测报告 5附录B（资料性附录） 大豆疫霉PCR检测试剂 6DB35/T1280—2012DB35/T1280—2012本标准按照GB/T1.1-2009的要求编写。本标准由福建省农业厅提岀并归口。本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：陈庆河、翁启勇、李本金、兰成忠、赵健、邱荣洲。DB35/T1280DB35/T1280—201222DB35/T1280—2012DB35/T1280—201211大豆疫霉菌分子检测技术规程1范围本标准规定了大豆疫霉菌PCR检测的样品制备、检测技术和操作程序。本标准适用于大豆植物组织及土壤中大豆疫霉菌的分子检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1巢式PCR(nestedPCR)是指利用两套PCR引物(巢式引物)对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性，又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的特异性。3原理大豆疫霉菌(Phytophthorasoja亩隶属鞭毛菌亚门，卵菌纲，霜霉目，腐霉科，疫霉属。真核生物核糖体基因包括5S、5.8S、18S、25S在内的4个rDNA基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度重复序列，由于其进化速率慢，常用于探讨科級和科級以上等级的分类、检测和鉴定。核糖体基因转录间隔区(InternaltranjiribedspacerITS)是介于18SrDNA、5.8SrDNA和25SrDNA之间的区域，该区域进化速率较编码区快，研究表明ITS在真菌的种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却高度保守，可以为病原菌的分子检测提供理想的靶序列。根据大豆疫霉菌ITS的特异序列，合成一对特异性引物，获得大豆疫霉菌特异性扩增片段，用于大豆疫霉菌的快速分子检测。4材料与试剂4.1主要仪器与器材1.1PCR检测仪4.1.2凝胶成像仪4.1.3台式离心机4.1.4涡旋混匀器4.1.5电泳仪4.2主要试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯。4.2.1苯酚；氯仿；异戊醇；乙醇4.2.2二甲基亚砜4.2.3氢氧化钠4.2.4脱脂奶粉4.2.5PCR常规试剂5采样5.1采样工具分样套筛、剪刀、镊子、1.5mL微量离心管、研钵。5.2样品采集5.2.1大豆植株采集疑似大豆疫病的植株根部及地表上2cm〜4cm的茎部样品。2.2土壤每块大豆田随机选5个点，取2cm〜15cm深度的50g土壤样品。5.3样品贮运样品采集后，放入密闭的容器内，送实验室。将取样结果进行记录，记录表格见附录A。5.4样品存放处理的样品应保存在-20°C以下，避免反复冻融。6操作方法1样本DNA制备6.1.1植物组织中病原菌DNA的提取取一段疑似病株组织，每毫克加入ionl0.5MNaOH,在研钵中充分研磨后移至1.5ml的离心管中，12000r/min离心5min,取5卩1上清液加入495卩10.1mMTris(pH8.0),混勾西取1卩1直接用于PCR反应。6.1.2土壤中DNA的提取经100目过筛后的土壤加入少量无菌水(10g土壤约加入5ml无菌水)后冷冻抽干24h~48h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500卩10.4%脱DB35/T1280—2012DB35/T1280—2012#附录A（资料性附录）

大豆疫霉菌样本检测报告

编号:样品种类取样时间取样地点样品数量取样部位送检日期送检人送检单位联系电话检测鉴定方法:检测鉴定结果:备注:检测人（签名）：审核人（签名）：检测单位盖章:

年月曰注：本单一式两联，第一联送检单位存档，第二联检测单位存档。DB35/T1280DB35/T1280—2012附录B（资料性附录）

大豆疫霉PCR检测试剂P