生物饵料培养教学资料

PAGE生物饵料培养绪论第一章光合细菌的培养第二章微藻的培养第三章轮虫的培养第四章卤虫的培养第五章其它生物饵料的培养教材：成永旭等，生物饵料培养学，中国农业出版社，2005年8月第2版.中文参考书陈明耀等，生物饵料培养，中国农业出版社，1995年10月第1版.梁英等，海水生物饵料培养技术，青岛海洋大学出版社，1998.外文参考书：1.AlgalCulturingTechniquesEditor:RobertA.AndersenPrice:$84.95Hardcover(精装本):578pagesPublisher:AcademicPress(2005.1.21)ISBN（书号）:0120884267注：海大图书馆有此书2.HandbookofMicroalgalCulture:BiotechnologyandAppliedPhycologyEditor:AmosRichmondPrice:$333.99Hardcover(精装本):584pagesPublisher:J,Wiley-Blackwell(2004.1)ISBN:97806320595393.PlanktonCultureManualEditor:FrankH.HoffandTerryW.SnellPrice:$70Softcover(平装本):183pagesPublisher:FloridaAquaFarms(2007)ISBN:97809662960444.Algae(2ndEdition)Editor:JamesE.Graham/LeeW.Wilcox/LindaE.GrahamPrice:$127.73Hardcover(精装本):584pagesPublisher:BenjaminCummings(2008.11.9)ISBN:9780321559654注：海大图书馆有此书的第1版。课程教学目标与基本要求主要内容:光合细菌、微藻、轮虫、卤虫等生物饵料的生物学特征、培养的基本技能和方法。基本要求:了解常用生物饵料的基本形态、生态特征掌握生物饵料培养的基本技能与方法达到能熟练运用所学知识与技能进行生产性培养的要求为开展生物饵料方面的研究工作打下基础绪论第一节生物饵料培养学的基本概念第二节生物饵料在水产养殖中的应用第三节生物饵料培养未来发展方向第一节生物饵料培养学的基本概念一、生物饵料培养学的定义饲料：饲养动物（禽、畜等）的食物。饵料：鱼、虾、贝等水产动物的食物。饵料生物:是指在海洋、江河、湖泊等水域中生活的各种可供水产动物食用的水生动、植物（微藻microalgae、轮虫rotifer、卤虫brineshrimp、桡足类copepod等）。生物饵料（livefood）:是经过筛选的优质饵料生物，进行人工培养后投喂给养殖对象食用的活的饵料。微粒饲料（microdiet）：将不同营养物质加工，配合，制成相应生物饵料大小的颗粒饲料产品，称微粒饲料。生物饵料培养学：是研究生物饵料的筛选、培养及其营养价值评价的一门应用性科学。主要任务：筛选优良生物饵料品种。提高生物饵料培养水平。研究和评价生物饵料的营养价值。二、生物饵料培养学的主要研究内容（一）生物饵料的筛选筛选原则：1．大小适中：不同的动物及同种动物的不同发育阶段对饵料大小的要求不同。扇贝幼虫的早期阶段：等鞭金藻等个体小、游动缓慢的种类。扇贝幼虫的后期阶段：扁藻、塔胞藻等个体较大，游动活泼的种类。球等鞭金藻：多用于培养扇贝(scallop)、贻贝(mussel)等双壳贝类的幼虫(larvae)角毛藻、杜氏藻：培养海参(seacucumber)幼虫小球藻、微绿球藻：多用于培养轮虫(rotifer)2．方便养殖动物摄食：生物饵料在水中的运动速度与在水层中的分布情况，应便于养殖动物摄食。微藻、轮虫：运动能力较弱——开口饵料卤虫无节幼体、枝角类、桡足类：游动较快扇贝幼虫：浮游生活，选用浮游生物饵料。鲍鱼苗（稚鲍）：底栖生活，选用底栖生物饵料。3．营养丰富容易被养殖动物消化吸收，具有较高的营养价值，使养殖动物生长迅速。营养价值：（1）测定营养成分：蛋白质（protein），脂肪（lipid）碳水化合物（carbohydrate），维生素（vitamins）脂肪酸（fattyacid），特别是高度不饱和脂肪酸Highunsaturatedfattyacid（HUFA）气相色谱-质谱仪（GC-MSGasChromatography-MassSpectrometer）：测脂肪酸傅立叶变换红外显微镜（FT-IRspectroscopy-Fouriertransforminfraredspectroscopy）：可测蛋白质、脂肪、碳水化合物等的相对含量（2）投喂效果实验：体长、体重增加的快慢等。4．生物饵料及其代谢产物无毒或毒性很小，使养殖动物具有较高的成活率。例微囊藻和螺旋藻。5．生物饵料的生活史短，生殖力强。如球等鞭金藻。6．对环境的适应性（对温度、盐度、光照强度等）和抗逆性强，易于大量培养(large-scaleculture)，培养达到的密度大，产量高。如褶皱臂尾轮虫。（二）生物饵料的大量培养技术研究生物饵料的基本生物学资料：形态、分类、分布种群的生理生态特证、生殖力、抗逆性大量培养的技术性指标（三）生物饵料的营养价值评价筛选、定向培养、营养强化第二节生物饵料在水产养殖中的应用育苗贝类育苗：微藻，常用硅藻类、金藻类和绿藻类。鲍鱼（底栖种类）育苗：底栖硅藻。甲壳类（虾、蟹等）育苗：微藻、轮虫、卤虫的无节幼体、桡足类等。鱼类育苗：轮虫、卤虫的无节幼体、桡足类、枝角类、糠虾类等。海参育苗：角毛藻、盐藻（杜氏藻）、底栖硅藻等。养成卤虫的成虫：是鱼、虾养成期的优质饵料。光合细菌：是鱼、虾池塘的水质净化剂。螺旋藻：蛋白质含量高于50%,是人工配合饵料的理想添加剂。第三节生物饵料培养未来发展方向一、生物饵料培养的中长期目标生物饵料规模化、稳定性、高密度培养技术饵料的营养强化新型生物饵料的筛选富含HUFA微藻品系的筛选生物饵料携带细菌数量的控制生物饵料在自然条件下的人工培养和增殖，人工生态育苗生物饵料的浓缩和保存二、生物饵料培养的终极目标苗种的饵料问题：水产苗种规模化和产业化的主要制约因素微粒饲料的完全取代：全价微粒饲料目前存在的问题：要求的粒径小，加工工艺复杂，微粒饲料的均质性难以保证营养成分在水中的稳定性难以保证微粒饲料在水中的悬浮性难以保证对鱼虾蟹幼体的营养需求了解较少第一章光合细菌的培养第一节光合细菌生物学特征第二节光合细菌的分离、培养和保藏第三节光合细菌的应用一、光合细菌定义光合细菌（photosyntheticbacteria），又称光养细菌（phototrophicbacteria），是能进行光合作用的一群原核生物。广义光合细菌：产氧光合细菌：蓝细菌（蓝藻）；不产氧光合细菌狭义光合细菌：不产氧光合细菌产氧光合作用和不产氧光合作用比较产氧光合作用不产氧光合作用涉及光反应系统光系统I和光系统IIPhotosystemIandII光系统IPhotosystemI光合色素叶绿素Chlorophyll细菌叶绿素供氢体水分子分子氢、硫化氢、硫、硫代硫酸钠等氧气有氧放出没有氧气产生涉及生物体蓝细菌和植物不产氧光合细菌二、发展简史20世纪60年代，日本科学家在观测高浓度的粪便污水自然放置时的菌数变化，发现污水的净化与光合细菌密切相关。20世纪70年代，光合细菌应用于生活污水的处理。20世纪90年代后，光合细菌广泛应用于水产养殖，人们发现光合细菌对家禽、家畜及鱼、虾、蟹、贝类幼体具有明显的促进生长和提高成活率作用。第一节光合细菌生物学特征光合细菌的分类根据目前最新的分类系统，将所有的光合细菌归为蓝细菌、紫色非硫细菌等8个类群。分属于真细菌域的5个门。8个类群：蓝细菌、绿色非硫细菌、绿色硫细菌、螺旋杆菌、紫色非硫细菌、好氧不产氧光合细菌、外硫红螺菌、着色菌等。除蓝细菌门进行产氧光合作用外，其余4门中的所有光合细菌均是不产氧光合细菌。目前广泛应用在水产上的光合细菌是紫色非硫细菌purplenon-sulfurphotosyntheticbacteria的一些种类。包括:红假单胞菌属红螺菌属红细菌属二、光合细菌的形态结构（一）形态光合细菌的菌体形态多种多样，有球形、卵形、杆形、弧形、螺旋形、环形、半环形、丝形等。不同的菌种形态各不相同。（二）细胞的大小：因种类不同变化很大。在水产上广泛应用的光合细菌：个体较小，<5微米绿色丝状菌科细胞：可长达300微米三、光合细菌的生理生化特性（一）色素组成1.细菌叶绿素（菌绿素）：有6种（a，b，c，d，e，g），吸收波长在715-1040nm，属于红外、远红外光区。菌绿素是光合细菌进行光合磷酸化，将光能转变成化学能的媒介。2.类胡萝卜素：为辅助色素，吸收波长400-500nm，有30多种。其主要功能有：①具光合作用活性，是将能量传递给菌绿素的天线色素；②可防止菌绿素免遭光氧化损伤，起光氧化保护剂作用；③其成分和数量决定菌体颜色。类胡萝卜素的组成成分和数量多少，影响吸收光谱的波长，对菌体的颜色起决定作用。紫色非硫细菌和着色菌科：呈红、粉红、橙黄、紫或茶褐色。是由于菌体内类胡萝卜素含量较高，掩盖了菌绿素的色素。绿杆菌科和绿色丝状菌科：呈绿色。类胡萝卜素含量少，显示出细菌叶绿素的蓝绿色。（二）营养代谢1.碳源：紫色非硫细菌以各种有机物作为供氢体，同时以这些有机物作为碳源利用。2.氮源：存在固氮酶，具固氮能力，又具有氢化酶的活性，能产生氢气。可利用铵盐、氨基氮、氮气；少数可利用硝酸盐和尿素。3.生长因子：紫色非硫细菌的细菌常需要某种B族维生素作为生长因子。酵母膏能促进大多数已知的紫色非硫细菌的生长。（三）分裂方式二分裂：大多数光合细菌出芽分裂方式极性伸长分裂（Polarelongation）四、光合细菌的生态分布广泛分布于地球生物圈的各处：海洋、湖泊、江河、水田、土壤、极地。90℃的温泉盐度为300的盐湖2000m的深海南极冰封的海岸五、光合细菌的营养1.蛋白质高达64.15-66.00%，氨基酸组成齐全，接近轮虫和枝角类；2.B族维生素含量丰富，特别是维生素B12、叶酸和生物素等含量丰富，是啤酒酵母和小球藻的20~60倍。3.富含重要生理活性物质辅酶Q。4.富含细菌叶绿素和类胡萝卜素，天然色素的良好来源。第二节光合细菌的分离、培养和保藏一、光合细菌的分离1.采样：选择被有机物污染的地方水中：水田、污水沟

，利用水勺或采水器；

污泥：池塘底、湖底、海底，利用采泥器。2.富集培养：选择适宜培养基，在厌气条件下（装满），温度（25-35℃），光照5000-10000lx。经2-8周培养，在瓶壁、瓶底或培养液中有红色出现，吸取红色液体继续反复多次提纯培养。3.分离方法：平板分离法，海水种生长慢约3周，淡水种生长快约1周。二、光合细菌的培养基培养基的组成因种类而异，主要包括：水分氮源（无机氮和有机氮）碳源（有机化合物和碳氢化合物）微量元素：铜、钾、镁、硫等，以无机盐形式添加培养基：液体培养基（liquidmedium）固体培养基：加入1.5-2.0%的琼脂半固体培养基：加入0.3-0.6%的琼脂光合细菌的培养基配方（p28-32）常用配方：磷酸氢二钾（K2HPO4） 0.5克磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.5克硫酸铵((NH4)2SO4) 1克乙酸钠(或95%酒精3ml) 2克硫酸镁（MgSO4.7H2O） 0.5克酵母浸出汁(或酵母膏) 2克消毒海水 1000毫升酵母膏、蛋白胨培养基：酵母膏3克蛋白胨3克CaCl2 0.3克MgSO4.7H2O 0.5克蒸馏水1000ml要求：PH6.8三、光合细菌的培养1、培养方式（1）全封闭式厌气光照培养：采用透光的玻璃容器或塑料桶（袋、瓶），接种量20-50%，使整个容器被液体充满，加盖扎口，造成厌气的培养环境，5-10天达高峰期。（2）开放式微气光照培养：采用100-200升的白色塑料桶等，微充气，接种量20-50%，7-10天达高峰期。缺点是易污染。2、培养流程（1）容器、工具的洗涤和消毒（2）培养基的制备（3）接种（4）培养管理（1）容器、工具的洗涤和消毒将容器、工具洗刷干净耐高温的容器、工具：直接灼烧、煮沸、烘箱干燥大型容器、工具及培养池：化学药品消毒常用的消毒药品：漂白粉（或漂白液）、酒精、盐酸、高锰酸钾等。（2）培养基的制备1）培养用水淡水种：菌种培养：蒸馏水；生产培养：消毒的自来水（或井水）海水种：天然海水2）培养基配制选择合适的培养基配方，把所需物质称量，逐一溶解，混合，配成培养基(medium)。也可先配成母液(concentratedsolutions,usually1000times)，使用时按比例加入一定的量即可。3）灭菌和消毒菌种培养用培养基：连同培养容器用高压灭菌锅（autoclave）灭菌。小型生产性培养：可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒。大型生产性培养：把经沉淀砂滤后的水用漂白粉（或漂白液）消毒后使用。（3）接种培养基配好后，应立即进行接种。光合细菌生产性培养的接种量比较高，一般为20—50%，即菌种母液量和新配培养液量之比为1：4—1：1.（4）培养管理1）搅拌和充气2）调节光照度3）调节温度4）酸碱度的测定和调整5）生长情况的观察和检查6）问题的分析和处理1）搅拌和充气小型厌气培养：摇动培养容器大型厌气培养：机械搅拌器或小水泵微气培养：充气2）调节光照度连续照明。白天：太阳光晚上：人工光源3）调节温度：23-39℃4）酸碱度的测定和调整常用醋酸来降低菌液的酸碱度5）生长情况的观察和检查肉眼观察（VisualInspection）：菌液的颜色是否正常，接种后颜色是否由浅变深。显微镜检查(MicroscopicExamination)。6）问题的分析和处理：内因：菌液是否优良外因：温度、光照、酸碱度、营养等四、光合细菌的保藏目的：将菌株的原始性状和优良性状保存下来，防止死亡、退化或杂菌污染。低温保存法：4℃左右低温冰箱保存，30-60d，口封蜡可保存3-4个月到半年。低温定期移植保存法：接种后培养至菌落形成，再移至低温、干燥处保存，3-6个月移植培养一次。液体石蜡法：石蜡需经灭菌和170℃干热去掉水分，冷却后覆盖菌落上，并封紧。冷冻干燥法：抽真空，4℃冰箱保存。变异少、保藏时间长，运输贮存方便。液氮超低温保藏法：保藏菌种的好方法。生产上保存光合细菌：光合细菌菌液保存期的长短主要取决于温度。通常在正常的连续的生产及使用过程中，对光合细菌的保存及留种无需做特别的处理。夏天在太阳下培养的光合细菌菌液就放于阳光下，可保6个月，可不断地再培养，扩大，反复等。秋天培养的光合细菌菌液最后一批产品可保1年之久。第三节光合细菌的应用一、光合细菌在水产养殖上的应用（一）水质净化剂光合细菌：光能异养菌以水体中的有机物质作为菌体生长、繁殖的营养成分。分解利用水体中的氨盐、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质（二）浮游动物的饵料用光合细菌和微藻的混合液培养卤虫、轮虫和枝角类，效果较好（生长繁殖速度加快，氨基酸和蛋白质含量增加）。（三）鱼、虾、贝幼体的饵料光合细菌营养价值高，在水产经济动物（鱼类、虾蟹类、贝类）均可作为辅助饵料投喂。作用：促进幼体生长、变态和提高成活率。（四）饲料添加剂可提高饲料效率，增加养殖动物的脂类和蛋白质含量。（五）预防疾病二、光合细菌在其他方面的应用1.环保：净化环境的生物制剂2.保健品：保健食品、药品。光合细菌浓缩液、饮料3.药用：富含ALA（5-氨基乙酰丙酸），可作为除草剂、杀虫剂、植物生长促进剂的药用成分4.产氢Hydrogenproduction：产氢不放氧，产氢纯度高，生物制氢三、光合细菌在应用上存在的问题1.菌种的特异性问题：不同种类作用效果不同、差别大。2.使用范围与方法：考虑生理和生态特性。海水种、淡水种要在抗生素停1-2天后添加使用选择晴天时泼于水中3.培养方法和工艺：封闭性、开放性4.作为饵料的添加量和添加方式：添加新鲜液体比干粉好光合细菌产品光合细菌冻干粉是新研制成功的一种高效浓缩光合细菌产品，本品通过先进的液体深层发酵技术和膜分离工艺，对光合细菌培养液进行浓缩提纯，经低温快速冷冻干燥复配而成，具有含量高、存活期长的特点。本品投放到水体后，处于休眠状态的菌群能快速复苏，以几何级数繁殖，在池中能迅速形成优势菌群，有效抑制致病菌的生存和繁殖，培育良好的养殖水色。第二章微藻培养第一节概述第二节主要培养种类及其生物学第三节影响微藻生长繁殖的因子第四节微藻的培养液第五节微藻的培养方式与设施第六节微藻培养方法第七节微藻在一次性培养中生长繁殖的特性第八节藻种第九节敌害生物的防治第一节概述一、微藻培养的发展概况微藻（microalgae）:指那些单细胞或数个细胞组成的微小藻类。16世纪：墨西哥人将螺旋藻晒干制成食品。19世纪末：开始进行微藻的培养，小球藻、栅藻等，作为植物生理学的材料。20世纪初：开始进行作为水产饵料的微藻培养。第二次世界大战后：开展小球藻培养研究，代替粮食和饲料。20世纪80年代末：开始进行微藻的异养培养（利用工厂的发酵设备）。我国的微藻事业：20世纪50年代后期：开展大规模小球藻培养。70年代后期：将螺旋藻引入我国。目前大规模培养的种类：螺旋藻、盐藻等。微藻产业发展较快的国家：以色列、日本、泰国、美国等。培养的主要种类：螺旋藻、盐藻、小球藻等。目前国内外水产养殖中，常用的微藻隶属于7个门，几十个属。二、微藻的应用1作为人类的营养食品和保健食品（螺旋藻、小球藻等）2作为药源生物资源（抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗心脑血管疾病）3作为人类食品添加剂(调色、调味)4作为水产动物的饵料（鲜活微藻、贮存微藻）5用富含EPA/DHA的微藻强化轮虫、卤虫6作为水产动物饵料添加剂和禽、畜饲料添加剂7

利用微藻提取EPA和DHA、色素、甘油等生物活性物质8废水处理9植物生长调节剂10作为生物柴油的原料（高效能源微藻）11微藻的危害（微藻毒素、赤潮等）第二节主要培养种类及其生物学硅藻类：三角褐指藻、小新月菱形藻、牟氏角毛藻、纤细角毛藻、中肋骨条藻绿藻类：亚心形扁藻、塔胞藻、杜氏藻、小球藻、微绿球藻、莱茵衣藻、栅藻、雨生红球藻金藻类：球等鞭金藻、湛江等鞭藻、绿色巴夫藻黄藻类：异胶藻蓝藻类：钝顶螺旋藻红藻类:紫球藻一、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)1.分类地位：硅藻门/羽纹硅藻纲/褐指藻目/褐指藻科/褐指藻属2.形态特征：细胞梭形、三角形、卵形。梭形细胞:长约20微米。三出放射形细胞:臂长皆为6-8微米。卵形细胞较少见，在平板培养基上培养可出现卵形细胞。3.繁殖方式：无性的二分裂繁殖。因无硅质壳，分裂时细胞不会缩小。4.生态条件：温度：生长适温5-25℃，最适温度10-20℃，超过25℃时停止生长，最终大量死亡。盐度：生存盐度9-92，最适盐度25-32。光照强度：适应光照强度范围1000-8000lx，最适范围3000-5000lx，切忌阳光直射。酸碱度：适应的pH范围为7-10，最适pH7.5-8.5。目前，三角褐指藻有多个品系(strains)，如MACC/B114，MACC/B118，MACC/B221，MACC/B229，MACC/B253，UTEX640，2038品系不同，细胞的形态及营养成分都有差异，应用时可根据需要选择合适的品系。MACC:MicroalgaeCultureCenterinOceanUniversityofChinaB:Bacillariophyta(硅藻门)UTEX：TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin(USA)二、小新月菱形藻（Nitzschiaclosteriumf.minutissima）1.分类地位：硅藻门/羽纹硅藻纲/管壳缝目/菱形藻科/菱形藻属2.形态特征：小新月菱形藻俗称“小硅藻”。单细胞,细胞中央膨大,呈纺锤形,两端渐尖。体长12-23微米，宽2-3微米。细胞中央具一细胞核。色素体2片，黄褐色，位于细胞中央细胞核两侧。3.繁殖方式：无性的二分裂繁殖。4.生态条件：温度：生长适温5~28℃，最适温度15℃~20℃，超过28℃时停止生长，最终大量死亡。盐度：生存盐度18-61.5，最适生长盐度25-32。光照强度：最适范围3000-8000lx，切忌阳光直射。酸碱度：适应的pH范围为7-10，最适pH7.5-8.5。三角褐指藻和小新月菱形藻：培养较早，培养方法比较成熟。具有生长快、浓度高、容易培养、营养丰富的特点，是贝类和虾类幼体的良好饵料。低温种（lowtemperature-tolerancespecies），25℃以上生长即受到严重抑制。这两种藻适温范围较窄，缺少耐5℃以下低温和耐28~30℃以上高温的品系，给育苗生产带来一定的影响。三、牟氏角毛藻（Chaetocerosmuelleri）1.分类地位：硅藻门/中心硅藻纲/盒形藻目/角毛藻科/角毛藻属2.形态特征：细胞：短圆柱形，壳面大都是椭圆形。壳环面呈长方形至四角形。细胞小型，多数呈单细胞，有时2-3个组成群体。角毛细长，约20-30微米。色素体1个，呈片状，黄褐色3.繁殖方式：无性的二分裂繁殖。当环境不良时可形成休眠孢子，此外，也能形成复大胞子。4.生态条件：温度：高温种类，生长适温10-40℃，最适温度25℃-35℃。盐度：半咸水种类，适宜盐度2.56-35，最适盐度22-26。光照强度：适宜光照强度范围2000-15000lx，最适范围6000-10000lx。酸碱度：适应的pH范围为6.4-9.5，最适pH8.0-8.9。四、纤细角毛藻（Chaetocerosgracilis）1.分类地位：硅藻门/中心硅藻纲/盒形藻目/角毛藻科/角毛藻属2.形态特征：细胞小型，多呈单细胞，有时2~3个细胞组成链状，大小5~7×4微米(角毛长30~37微米)。本种是1988年从美国SolarEnergyInstitute引进的，并已在国内育苗场推广应用。3.繁殖方式：一般是无性二分裂繁殖，在不良环境下可形成休眠孢子。4.生态条件：同牟氏角毛藻。高温种类。牟氏角毛藻和纤细角毛藻可以作为海参(seacucumber)、甲壳类(crustaceans)等幼体的饵料。耐高温种类(hightemperature-tolerancespecies)，适合夏季培养。五、中肋骨条藻（Skeletonemacostatum）1.分类地位：硅藻门/中心硅藻纲/圆筛藻目/骨条藻科/骨条藻属2.形态特征：细胞为透镜形或圆柱形，直径为6-7微米。壳面圆而鼓起，着生一圈细长的刺，与临细胞的对应刺组成长链。刺的数目为8-30条。色素体通常2个，位于壳面各向一面弯曲。3.繁殖方式：一般为无性的二分裂繁殖。复大孢子是经过卵配形成的。复大孢子的形成与温度、盐度和光照有关。4.生态条件：温度：生长适温10~34℃，最适温度20℃~30℃。盐度：生存盐度7-50，最适生长盐度25-30。光照强度：适应范围500-10000lx。酸碱度：最适pH7.5-8.5。中肋骨条藻：广温广盐种类，是对虾幼体、缢蛏、牡蛎等的优良饵料。六、亚心形扁藻（Platymonassubcordiformis）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/衣藻科/扁藻属国外多使用另一分类系统，该系统根据细胞前端的凹陷独立为一纲，即：绿枝藻纲Prasinophyceae四爿藻属Tetraselmis，因此扁藻属Platymonas与四爿藻属Tetraselmis为同属异名。扁藻的形态特征：2.形态特征：单细胞，正面观为卵形、椭圆形或心形。具4条等长的顶生鞭毛(flagella)，约等于或略短于体长。色素体大，呈杯状(cup-shaped)，内有一个蛋白核(pyrenoid)。眼点(eyespot)1个，细胞核1个。我国作为饵料培养的种类还有青岛大扁藻，比亚心形扁藻大。3.繁殖方式：无性繁殖，细胞纵分裂成两个（少数情况下四个）子细胞。当环境不良时，能形成休眠孢子，椭圆形，一个或两个。4.生态条件：温度：生长适温7~30℃，最适温度20℃~28℃。对低温的适应能力强，对高温的适应能力差。盐度：生存盐度8-80，最适生长盐度30-40。光照强度：适应范围1000-20000lx，最适范围5000-10000lx。酸碱度：适应的pH范围为6-9，最适pH7.5-8.5。七、塔胞藻(Pyramidomonassp.）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/盐藻科/塔胞藻属2.形态特征：单细胞，细胞呈倒卵形，少数为半球形。细胞前端具一圆锥形凹陷，由凹陷中央向前伸出4条鞭毛。色素体杯状，基部有一个蛋白核。细胞单核，位于细胞的中央偏前端。细胞裸露，不具细胞壁(Cellwall)。3.繁殖方式：主要为纵分裂繁殖。4.生态条件：同扁藻。塔胞藻是水产动物的优质饵料，但对塔胞藻生态条件的报道很少，培养过程中一般采用扁藻的培养条件。我们对塔胞藻进行的盐度实验（1-120）结果表明，塔胞藻生长的最适盐度是10-50，进行光合作用的最适盐度为20。扁藻和塔胞藻适应力较强，生长繁殖迅速，较容易培养，是亲贝和许多贝类后期幼虫的良好饵料。八、盐藻（Dunaliellaspp.）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/盐藻科/盐藻属（杜氏藻属）2.形态特征：单细胞，无细胞壁(nocellwall)，体形变化大，通常为梨形、椭圆形等。具两条等长顶生鞭毛(twoequalflagella)，比藻体约长1/3。色素体杯状，内有一个蛋白核。一般细胞长12-21微米，宽约6-13微米。常见品系：MACC/C43，MACC/C463.繁殖方式：主要为无性纵分裂繁殖。在环境不良时进行有性生殖。4.生态条件：温度：最适温度20℃~35℃。盐度：最适盐度60-70。光照强度：最适范围4000-8000lx，切忌阳光直射。酸碱度：对pH适应性强，可在高pH的碱性条件下生长，最适pH7.0-8.5。盐藻细胞内能储存大量经济价值较高的甘油和β-胡萝卜素等有机化合物，可通过大量培养杜氏藻提取β-胡萝卜素。九、莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardii）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/衣藻科/衣藻属2.形态特征：和盐藻形状相似，藻体为游动单细胞，细胞球形、卵形等。细胞前端具2条等长的鞭毛。具一个大型色素体，多数杯状，常具1个大的蛋白核。眼点位于细胞的一侧，橘红色。细胞核位于细胞中央偏前端。3.繁殖方式：生长旺盛时以无性繁殖为主，细胞分裂成2-16个动孢子；环境不良时形成胶群体。4.生态条件：主要分布在淡水中。对环境的适应能力较强。长期以来作为细胞遗传学和分子遗传学的材料。十、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/团藻目/红球藻科/红球藻属2.形态特征：单细胞，细胞为椭圆形到卵形。细胞壁与原生质体之间有一定间距，充满胶状物质。两条等长鞭毛，约等于体长。环境不良时，产生厚壁孢子，积累大量的虾青素。淡水种。3.繁殖方式：环境适宜时，游动细胞以无性繁殖方式产生2、4、8个游孢子。经一定时间的生长发育，游孢子突破孢子囊壁释放出来，成为新的游动细胞。4.生态条件：温度：生长适温20~28℃，超过30℃时生长受到抑制。盐度：淡水种。光照强度：最适光强1500lx左右，高于2500lx则抑制其生长，转为休眠状态。(与实验结果相差较大，有待于确认)，红光比蓝光对该藻的生长有利。酸碱度：最适pH7.8左右。雨生红球藻：含大量的虾青素（细胞干重的2%）是目前已知的虾青素含量最高的微藻虾青素的用途：虾青素是鲑鳟鱼饲料中必不可少的成分作为天然抗氧化剂应用于食品、医药、化妆品。虾青素是一种脂溶性类胡萝卜素（也是一种红色素），其抗氧化能力是普通维生素E的550倍，天然β－胡萝卜素的10倍。经过10多年的医学研究，虾青素可有效清除肌细胞中因运动产生的自由基，强化需氧代谢，具有显著的抗疲劳、抗衰老作用。国际上已利用天然虾青素开发出了大量的高级营养保健食品和药品。十一、小球藻（Chlorellaspp.）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/绿球藻目/小球藻科/小球藻属2.形态特征：单细胞，小型，细胞直径2-12μm。细胞球形或椭圆形。色素体一个，周生，杯状或片状。大多数淡水生活，少数海水中生活。3.繁殖方式：当细胞分裂时，原生质体分裂为2、4、8、…个似亲孢子，等到母细胞壁破裂，似亲孢子就释放出来。4.生态条件：温度：生长适温10~36℃，最适温度25℃-30℃。盐度：适应盐度范围广。经驯化可在淡水及盐度为45的海水中生长繁殖。光照强度：最适范围3000-10000lx。酸碱度：适应的pH范围为5.5-8.0。小球藻蛋白质含量丰富，可生产保健食品。在水产上，小球藻多用于培养轮虫十二、微绿球藻（Nannochlorisoculata）1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/绿球藻目/绿球藻科/微绿球藻属2.形态特征：细胞球形，直径2-4微米。色素体一个，淡绿色，侧生。眼点一个，圆形，淡橘红色。无蛋白核，有淀粉粒1-3个，侧生。细胞壁极薄，幼年细胞看不到，在-分裂之前才变明显。3.繁殖方式：二分裂繁殖，细胞分裂为2个子细胞。4.生态条件：温度：生长适温10~36℃，最适温度25~30℃。盐度：适宜盐度范围4-36。光照强度：最适光照强度为10000lx左右。酸碱度：最适pH7.5-8.5。微绿球藻多用于培养轮虫十三、栅藻Scenedesmusspp.1.分类地位：绿藻门/绿藻纲/绿球藻目/栅藻科/栅藻属2.形态特征：群体由2-32个细胞（多为4-8个）组成。极少数为单细胞。细胞纺锤形、卵形、椭圆形等。细胞壁平滑，或具刺或齿状突起。有1个周生色素体和1个蛋白核。常见种类：斜生栅藻、四尾栅藻等。3.繁殖方式：仅以似亲孢子进行无性繁殖。4.生态条件：主要分布在淡水中。静止且有机物较丰富的小水体更适合其生长繁殖。温度：生长适温31~36℃。盐度：淡水种，在盐度为10以下的水中生存。十四、球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）1.分类地位：金藻门/金藻纲/等鞭金藻科/等鞭金藻属2.形态特征：单细胞，细胞裸露，椭圆形、卵形、球型等。具2条等长鞭毛(twoequalflagella)色素体1-2个。贮藏物为油滴和白糖素，白糖素位于细胞后端。3.繁殖方式：主要为无性的二分裂繁殖。环境不良时形成特殊的孢囊-内生孢子。4.生态条件：球等鞭金藻有三个常见的生态品系球等鞭金藻3011(高温品系hightemperature-tolerancespecies)球等鞭金藻8701(低温品系lowtemperature-tolerancespecies)球等鞭金藻塔溪堤品系（TahitianIsochrysisgalbana），简称塔溪堤，最初从塔溪堤（南太平洋的一个岛屿）养殖水体分离筛选而得，属高温品系。生产上还有2066、H66等代号的金藻十五、湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis）1.分类地位：金藻门/金藻纲/等鞭金藻科/等鞭金藻属2.形态特征：多为卵形或球形，大小为6~7×5~6微米。具有两条等长的鞭毛，从细胞前端伸出。色素体两片，侧生，金黄色。细胞核位于两片色素体之间。一个或几个白糖素颗粒,位于细胞后部。3.繁殖方式：主要为无性二分裂繁殖。4.生态条件：温度：生长适温9~35℃，最适温度25℃~32℃。盐度：生存盐度10-50，最适生长盐度22.7-35.8。光照强度：最适范围5000-10000lx。酸碱度：最适pH7.5-8.5。球等鞭金藻和湛江等鞭金藻（生产单位称为“叉鞭”）可以作为扇贝（scallop）、牡蛎（oyster）等多种双壳类（bivalves)幼虫（larvae）的饵料，效果良好。大多数等鞭藻富含DHA。十六、绿色巴夫藻（Pavlovaviridis）1.分类地位：金藻门/金藻纲/巴夫藻属2.形态特征：绿色巴夫藻，又称3012，是1982年从山东海阳县的海水样品中分离而得。无细胞壁（cellwall），正面观呈圆形，侧面观为椭圆形或倒卵形。细胞大小为6.0×4.8×4.0微米。具2条不等长的鞭毛和1条附鞭。色素体一个，裂成2大叶围绕着细胞。绿色巴夫藻的群体细胞呈淡黄绿色至绿色。绿色巴夫藻可用于海湾扇贝（Bayscallop）和中国对虾育苗中，效果良好。3.繁殖方式：主要为无性二分裂繁殖。4.生态条件：温度：生长适温10~35℃，最适温度15℃~30℃。盐度：生存盐度5-80，最适生长盐度10-40。光照强度：最适范围4000-10000lx。酸碱度：最适pH7.5-8.5。十七、异胶藻（Heterogloeasp.）1.分类地位：黄藻门/黄藻纲/异球藻目/异胶藻属2.形态特征：细胞长圆形或椭圆形。长4~5.5微米，宽2.5~4微米。色素体1个，片状侧生，占藻体大部分，呈黄绿色。藻液颜色随着培养时间的延长从绿色变成黄色、土黄色。可作为牡蛎(oyster)、贻贝(mussel)、菲律宾蛤仔(clam)、泥蚶(mudclam)等幼体的饵料。3.繁殖方式：主要为无性二分裂繁殖。4.生态条件：温度：生长适温8~35℃，最适温度15℃~33℃。盐度：生存盐度13-32。光照强度：适应范围1000-8000lx。酸碱度：最适pH7.5-8.2。十八、钝顶螺旋藻（Spirulinaplatensis）1.分类地位：蓝藻门/蓝藻纲/颤藻目/螺旋藻属2.形态特征：藻体淡蓝绿色，细胞圆柱形。藻体为单列细胞组成的不分支的丝状体，丝状体外无胶质鞘。藻丝螺旋状卷曲。无异形胞和厚壁孢子(Noheterocystsandrestingspores)。海、淡水中均有分布。3.繁殖方式：主要为无性二分裂繁殖，有时也以藻殖段繁殖。4.生态条件：分布广，适应能力强，最初生长于热带高温的碱水湖里，喜高温、高碱和强光。实验室长期培养藻丝易变直。温度：生长适温15~40℃，最适温度35℃~37℃。盐度：可在淡水中培养，也可驯化后在盐度为35的海水中生长。光照强度：最适范围30000-35000lx。酸碱度：最适pH8.5-10.5。螺旋藻营养丰富、蛋白质含量高（达50%以上）容易消化、采收方便，多作为营养保健品。在水产上，螺旋藻可作为鱼、虾饲料添加剂。十九、紫球藻（Porphyridiumcruentum）1.分类地位：红藻门/红藻纲/红毛菜目/紫球藻科/紫球藻属2.形态特征：藻体单细胞，常不规则地聚在一起，外被一层薄胶膜。细胞多数球形，直径5-24微米，血红色，具一个色素体及一个蛋白核。含有藻红蛋白，藻蓝蛋白，紫球藻多糖等生物活性物质，AA、EPA等多不饱和脂肪酸含量丰富。3.繁殖方式：细胞分裂。4.生态条件：温度：生长适温10~35℃，最适温度21℃~26℃。盐度：生存盐度0.5-60，培养盐度35-46。光照强度：对光照强度的适应能力很强，在高光强下没有发现生长被抑制。酸碱度：适应的pH范围为5.2-8.3，最适pH7.5左右。第三节影响微藻生长繁殖的因子一、光照（Light）二、温度（Temperature）三、盐度（Salinity）四、营养盐（Nutrients）五、二氧化碳（Carbondioxide）六、pH（酸碱度Acidity）七、生物因子（Bioticfactors）光照（Light）1.光源太阳光（主要）人工光源（补充光源）常用的人工光源有:日光灯(fluorescentlamp)白炽灯(incandescentlamp,notrecommended)金属卤素灯(metalhalidelamp)2.光质在植物的光合作用中，光质(lightspectrum)和光量(lightintensity)都是重要的。光质：就是不同波长的光线，在太阳光光谱中，可分为3个主要部分，波长由短到长分别为紫外线、可见光（400-700nm）和红外线。光合有效辐射(photosyntheticallyactiveradiationPAR)：400-700nm3.光在藻细胞悬浮液中的穿透光线进入藻液中，由于藻细胞的吸收和散射，随着深度的增加，光照强度迅速降低。Lightintensityplaysanimportantrole,buttherequirementsvarygreatlywiththeculturedepthandthedensityofthealgalculture.Athigherdepthsandcellconcentrationsthelightintensitymustbeincreasedtopenetratethroughtheculture(e.g.1000lxissuitableforsmallflasks,5000-10000lxisrequiredforlargervolumes).4.光强光量：是指光线总强度而言，称光照强度。光照强度用照度计(lxlightmeter)测定，其单位是勒克司（lx）。在植物生理研究领域及国外：光照强度常用mmolphotons.m-2.s-1表示,即每秒钟在每平方米面积上接受的微摩尔量子光量。用量子辐射计、双辐射计、光量子计等测量。1mmolphotons.m-2.s-1»50lx适光范围：是指生物能进行正常生长繁殖的光照强度范围。饱和光照强度：光合作用或细胞分裂速率达到最大值时的光照强度称为最适光照强度或称饱和光照强度。补偿光照强度：适光范围的低限，称为补偿光照强度（光补偿点）。在这样的光照强度下，藻类呼吸作用消耗的氧气量与光合作用放出的氧气量恰好相等，细胞只能维持基础代谢不能生长。5.光周期（Photoperiod）光照周期12L:12D，光暗周期14h:10h，16:08light:darkcycle饱和白昼现象：在较强的光照强度和较长的日照时间下，日照时间虽然增加，生长率并不再增加，这种现象称为饱和白昼现象。光抑制（photoinhibition）:过强和过长时间的光照会引起光抑制，使叶绿素发生光解而褪色。Toohighlightintensity(e.g.directsunlight,smallcontainerclosetoartificiallight)mayresultinphotoinhibition.6.间歇光的作用：用强光间歇照射时，和间歇照射时间总和相等的连续照射相比较，同化效果要大很多。二、温度（Temperature）适温范围：是指微藻能进行正常生长繁殖的温度范围。最适温度范围：是指微藻生长繁殖最快、生命活动最旺盛的温度范围。最低适应温度（低限）最高适应温度（高限）认为高温对生物体的破坏是化学性的，低温对生物体的破坏是机械性的，微藻对低温的忍耐性较强，可利用低温对微藻进行保种。若温度超出最低适温和最高适温，生物的生命活动就要受到影响。例如：骨条藻的适温范围为8—32℃，最适温度范围20—25℃，适温低限和适温高限分别为8℃和32℃。常见低温种类：三角褐指藻、小新月菱形藻等。常见高温种类：角毛藻、湛江等鞭藻、等鞭藻3011等。Theoptimaltemperatureforphytoplanktonculturesisgenerallybetween20and24℃,althoughthismayvarywiththespeciesandstrainscultured.Mostcommonlyculturedmicroalgalspeciestoleratetemperaturesbetween16and27℃.Temperatureslowerthan16℃willslowdowngrowth,whereasthosehigherthan35℃arelethal(有害的、致命的)foranumberofspecies.三、盐度（Salinity）水是一种富含各种盐类的溶液，地球上不同水域的水，含盐量的差别很大。淡水水域：0.01~0.5半咸水：0.5~16.0海水水域：16.7~47.0超盐水域：47.0以上大洋水和径流降水较少的海区：35左右。盐度单位：ppt(partsperthousand)海水盐度对微藻的影响也有适盐范围、最适盐度范围、适盐高限和适盐低限等。以骨条藻为例，其适盐范围为7—50，最适盐度范围为25—30，适盐低限和适盐高限分别为7和50。四、营养盐（Nutrients）大量元素（macronutrients）微量元素（tracemetals）维生素（vitamins）络合物（Chelators）土壤抽取液（soilextract）微藻生长必需的每一种元素浓度：最低量（低限）：低于最低限，对生长繁殖起抑制作用最高量（高限）：超出高限，对微藻产生毒害作用影响其生长繁殖，甚至使微藻死亡。危害比前者更为严重。需要特别注意的是，微量元素的适量和致毒量之间的幅度很小。Manyreactivemicronutrientmetals,suchascopperandzinc,aretoxicatelevatedconcentrations.Forthesemetals,optimalgrowthoccursatintermediateconcentrations,belowwhichgrowthrateislimitedandabovewhichgrowthisinhibited.五、二氧化碳（carbondioxide）光合作用的反应式：CO2+H2O®（CH2O）+O2培养微藻的水环境中，二氧化碳呈现各种形式：游离的二氧化碳（CO2）碳酸氢盐（HCO3－）碳酸盐（CO32－）碳酸（H2CO3）各种存在形式在水中可互相转化。反应式为：CO2+H2OÛH2CO3ÛH++HCO3—Û2H++CO32—培养微藻过程中主要采用以下措施补充二氧化碳：（1）通过搅拌增加水与空气的接触面，使空气中的二氧化碳溶于培养液中。（2）通入普通空气（含二氧化碳0.03%），通过微小气泡增加水和空气的接触面，使空气中的二氧化碳溶入培养液中。（3）通入含1%—5%二氧化碳的混合空气，效果好，但要防止过量致毒。（4）向培养液中添加碳酸氢钠（容易引起沉淀）。六、pH（酸碱度Acidity）天然海水：pH值8.1-8.3人工海水：一般调整为8.2左右七、生物因子（Bioticfactors）促进生长：某些微藻（如日本星杆藻、骨条藻等）必须在有细菌存在的条件下才能生长良好。抑制生长：吞食、寄生和抗生等。第四节微藻的培养液一、培养液的成分二、常用微藻培养液配方三、培养液的配制Concentrationsofcellsinphytoplanktonculturesaregenerallyhigherthanthosefoundinnature.Algalculturesmustthereforebeenrichedwithnutrientstomakeupforthedeficienciesintheseawater.一、培养液的成分大量元素（macronutrients)微量元素（traceelements）维生素（vitamins）络合物（chelators）土壤抽取液（soilextract）1．大量元素（macronutrients）氮（N）、磷（P）、铁（Fe）、钾（K）、镁（Mg）、硫（S）、钙（Ca）、硅（Si）氮（N）硝酸钠和硝酸钾磷（P）磷酸二氢钾，磷酸二氢钠。铁（Fe）柠檬酸铁硅（Si）硅酸钠。Redfield比值N:P≈16:1若N:P≈30，则P为限制性元素N:P≈5，则N为限制性元素大量元素母液（Stocksolutionsofmacronutrients）Separatestocksolutionsofeachmacronutrientshouldbepreparedataconcentrationof1000-foldofthefinalconcentrationsoastouse1mlper1000mlofmedium.Phosphatestocksolutionsshouldneverbestoredinthepolyethylene（聚乙烯）bottlesbecausephosphateionsarestronglyadsorbedontopolyethylene.Silicatestocksolutionsshouldbestoredinnonvitreous（非玻化的）material(e.g.,Teflon-lined（聚四氟乙烯）,polyethylene,orpolycarbonate（聚碳酸酯）becauseofdissolutionofsilicicacidfromglassvessels.Ifsilica-freeexperimentisrequired,noneofthestocksolutionscanbeheldinglass.2.微量元素（Traceelements）微藻培养液中常用的微量元素有以下几种，其用量一般为0.5—50ppb。锌（Zn）硫酸锌（ZnSO4.4H2O）铜（Cu）硫酸铜（CuSO4.5H2O）锰（Mn）氯化锰（MnCl2.4H2O）钼（Mo）钼酸钠（NaMoO4.2H2O）钴（Co）氯化钴（CoCl2.6H2O）3.维生素（Vitamins）Threevitamins—vitaminB12，B1andbiotin（生物素，维生素H）areusuallyusedforcultureofmicroalgae.Manyalgaeneedonlyoneortwoofthevitamins,butthereseemstobenoharmcausedbyaddinganonessential.ThegeneralorderofvitaminrequirementsforalgaeisvitaminB12>B1>biotin.Tracemetalsandvitaminsareusuallypreparedasstocksolutionsofhighconcentrationstopermitweighingofeasonableamounts.4.土壤抽取液（Soilextract）(p85)Inthesimplestmedia,onlynitrogenandphosphorusandsoilextractareaddedtoNW(Naturalseawater).Erdschreiberisanexampleofsuchamedium,andithasbeenusedsuccessfullytogrowvariousplanktonicandbenthicspecies.Someculturecollectionsstillusesoilextracttomaintainsomespecies(Plymouth),butitisseldomusedinphysiologicalexperimentswhenadefinedmediumispreferred.5.络合物（Chelators）:乙二胺四乙酸（EDTA）或其钠盐Na2EDTAEDTAorNa2EDTAareaddedtokeepiron(Fe)insolutionandtokeepfreeionicmetal（金属离子）concentrationsatnontoxiclevels.However,EDTAhasbeennotedtoinhibitthegrowthofsomeoceanicspecies.Forroutineuseinculturemedia,nitrilotriaceticacid(NTA,次氮基三乙酸)andcitricacid(柠檬酸)arelesseffectivethanEDTA,buttheyareusedsometimesinexperimentalwork.二、常用微藻培养液配方F/2培养基（F/2Medium）(GuillardandRyther1962,Guillard1975)Thisisacommonandwidelyusedgeneralenrichedseawatermediumdesignedforgrowingcoastalmarinealgae,especiallydiatoms.Theconcentrationoftheoriginalformulation,termed“fMedium”(GuillardandRyther1962),hasbeenreducedbyhalf(Guillard1975).Ifsilicateisnotrequired,omittoreduceprecipitation(沉淀).F/2Medium（前：国内教材p79；后：Algalculturingtechniques）硝酸钠（NaNO3) 74.8mg（75mg）磷酸二氢钠（NaH2PO4） 4.4mg（5mg）硅酸钠（Na2SiO3.9H2O） 8.4~16.7mg（30mg）F/2微量元素溶液 1mlF/2维生素溶液 1ml消毒海水 1000ml附I：F/2微量元素溶液配方（前：国内教材p79；后：Algalculturingtechniques）柠檬酸铁（FeC6H5O7.5H2O） 3.9g乙二铵四乙酸钠（Na2EDTA） 4.35g氯化锰（MnCl2.4H2O） 178mg（180mg）硫酸锌（ZnSO4.4H2O） 23mg氯化钴（CoCl2.6H2O） 12mg（10mg）硫酸铜（CuSO4.5H2O） 10mg（9.8mg）钼酸钠（Na2MoO4.2H2O） 7.3mg（6.3mg）纯水（dH2O） 1000ml附II：F/2维生素溶液配方维生素B12 0.5毫克维生素H(生物素) 0.5毫克维生素B1 100毫克纯水 1000毫升维生素B11支2ml,含维生素B1100mg维生素B121支1ml,含维生素B120.5mg生产上用硅藻培养液配方硝酸钠（NaNO3） 50g-80g（或15g硝酸钠+20g尿素）磷酸二氢钠或钾（NaH2PO4） 4-8g硅酸钠（Na2SiO3） 4.5-5g柠檬酸铁（FeC6H5O7） 0.5g-1g消毒海水 1m3适合生产上培养三角褐指藻、小新月菱形藻和角毛藻。生产上用金藻培养液配方硝酸钠（NaNO3） 50g-80g（或30g硝酸钠+15g尿素）磷酸二氢钠或钾（NaH2PO4） 4-8g柠檬酸铁（FeC6H5O7） 0.5g-1g维生素B1 100mg维生素B12 0.5mg消毒海水 1m3适合生产上培养等鞭金藻3011、8701和湛江等鞭金藻等。生产上用绿藻培养液配方：硝酸钠（NaNO3） 60g尿素 18g磷酸二氢钠或钾（NaH2PO4） 4-8g柠檬酸铁（FeC6H5O7） 0.5g-1g消毒海水 1m3适合生产上培养扁藻、塔胞藻等康威培养液康威培养液三、培养液的配制实验室及生产上培养一级藻种用的营养盐：用试剂级（reagentgradechemicals），将各种元素分别配成母液(Concentratedsolutions)，用时吸取一定量即可。生产上大规模培养的营养盐：用农用肥料(agriculturalfertilizers)或工业肥料。配成母液，用时取一定量即可。按配方称取，加消毒水溶化后倒入池中。培养液灭菌或消毒：主要元素的母液及微量元素母液：高压灭菌或用滤膜过滤（实验室）煮沸消毒（生产上）维生素溶液：对容器和水分别进行消毒或灭菌滤膜过滤。VitaminsVitaminsarenormallyaddedaseptically(无菌的)(througha0.2mmfilter)afterthemediumhasbeenautoclaved.Vitaminsmaintainmaximumpotencyiftheyarefiltersterilized(0.2-µmfiltration)ratherthanautoclaved.Autoclavingmaycausedecomposition（分解）ofsomevitamins,butitisthoughtthatsomealgaemaybeabletousesomeofthesedecompositionproducts.Vitaminstocksmaybefrozenforlongperiodswithoutnoticeabledegradation（降级、退化）,andthestocksmayberefrozenaftereachuse.Thesethreevitaminstocksmaybecombinedintoasingleworkingsolutionfora1,000-folddilution.第五节微藻的培养方式与设施一、微藻培养方式1.纯培养、单种培养、混合培养是按培养的纯度来划分的。纯培养（axeniccultureorbacteria-freeculture）：即无菌培养,是指排除了细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。纯培养要求有无菌室、超净工作台等设备条件，容器、工具、培养液等必须严格灭菌。单种培养（unialgalculture）：在培养过程中不排除细菌存在的一种培养方式，称为单种培养。混合培养(mixedculture)：各藻种混杂在一起的培养方式。例如水样采集后单一藻种分离前的预备培养。2.封闭式培养与开放式培养是按照藻液与外界的接触程度划分的。封闭式培养（closedculture）开放式培养（openculture）封闭式培养：三角烧瓶、细口瓶、矿泉水桶、塑料薄膜袋、白色塑料桶（大白桶）、光生物反应器等。开放式培养：以水泥池开放式培养为主。3.一次培养、连续培养和半连续培养是按采收方式划分的。一次培养（Batchculture）：在一定的容器中，配成培养液，把少量的藻种接种进去，然后在适宜于藻类生长的环境条件下培养，经过一定时间（5-7天），待藻液达到一定的密度后，便一次性采收或作进一步扩大培养。半连续培养（Semi-continuousculture）：是指在一次培养的基础上，当藻类细胞达到一定密度后，每天（或隔天）收获一部分浓藻液，并加入新的培养液继续培养。科研上:保持细胞密度和营养盐浓度相对恒定.生产中:每天（或隔天）的收获量根据育苗的需要及藻液的生长情况确定。连续培养（Continuousculture）在培养容器内，新的培养液不断流入，达到一定密度的藻液不断流出。一般在室内进行，采用自动控温、人工光源、封闭式通气培养。恒浊培养：保持藻液细胞密度恒定。恒化培养：保持藻液营养盐浓度恒定。细胞密度：由光电仪器自动监测（光密度值）。4.一级培养、二级培养和三级培养是按培养的规模和目的来划分的。（1）一级培养（藻种培养）：目的：保种和供应藻种。室内进行，封闭式不充气一次性培养法。培养容器：100-5000毫升的三角烧瓶（conicalflask）、细口瓶、矿泉水桶等。瓶口：用消毒的纸、无菌封口膜、纱布或脱脂棉包扎，有时在外面再包上锡纸（铝箔，aluminumfoil）。（2）二级培养（中继培养）目的:扩种，培养较大量的高密度藻液，供应生产性培养接种使用。培养容器和培养方式：0.3-1.0方的白色塑料桶：封闭式充气一次性培养塑料薄膜袋：一般用透明薄膜制成，大小不等。采用封闭式充气一次性培养0.5-1.0方的小型水泥池：开放式培养（3）三级培养（生产性培养）目的：大量培养，供给育苗中的饵料。培养容器和培养方式：大型水泥池：室内或室外：开放式充气培养大型玻璃钢水槽：室内或室外：开放式充气培养塑料大袋：封闭式充气培养光生物反应器：封闭式充气培养5．自养培养、异养培养和兼养培养是按碳的主要来源和能量来源划分的。自养培养（autotrophicculture）：是一种传统的培养方式，是利用光能、以二氧化碳为主要碳源进行的培养。异养培养（heterotrophicculture）：以可利用有机碳（葡萄糖、醋酸盐等）作为唯一碳源和能源进行的培养，具有易进行高密度的纯种培养、可实现培养条件的自动控制等优点。兼养培养（mixotrophicculture）：是介于自养培养和异养培养之间的一种培养方式。是利用光能，以可利用有机碳（葡萄糖、醋酸盐等）作为碳源进行的培养。二、微藻培养设施1.观察室：配备显微镜、血球计数板、计数器、天平、常用的其它仪器、工具、药品等。可以进行藻种的检查、分离，药品的称量和配制等。2.清洗消毒室配备有清洗水池、消毒池(盆)、烘箱、高压灭菌锅、电炉、电磁炉、液化气灶等设备。可以供少量海水、培养基、容器、工具消毒。3.一级保种室作用：主要用于一级藻种的培养和保存。要求室内光线充足，最好配备人工光源。通风良好，室温最好可调整。室内主要设施为培养架（木、铝合金、钢筋水泥结构，2-4层）或光照培养箱。主要培养容器：三角烧瓶：100~5000mL细口玻璃瓶：1万~2万mL矿泉水桶：18.9L4.二级培养室作用：用于藻种的二级培养（中继培养）。要求光线充足，通风良好，四周宽敞。配备控温设施及充气设施。主要培养容器：白色塑料桶：0.3-1.0m3。小型水泥池：0.5-1.0m3塑料薄膜袋：一般用透明薄膜制成，大小不等。5.三级培养室作用：进行藻种的大规模培养。要求光线充足，通风良好，四周宽敞。房顶部用玻璃钢瓦或白色透明塑料薄膜覆盖，透光度70~80%。池水面上方安装日光灯、节能灯等人工光源。室内的主要设施:各种水泥池、大型玻璃钢水槽、大塑料薄膜袋。6.水处理系统（1）沉淀池作用：沉淀海水。沉淀时间：24-48h以上。结构：一般长方形或圆形，池底有一定的坡度，一般可分为2~数格。（2）水过滤装置砂滤池砂滤罐陶瓷过滤器（3）海水消毒池（配水池）微藻生产性培养用水，在经过沉淀砂滤后，常用漂白粉或漂白液处理，杀死水中的微生物。使用漂白粉等化学药品消毒海水，需要配备2-3个专用的海水消毒池，交替消毒和供水。池深：1.5-2.0m容量：能满足1天的培养用水量而略有剩余。海水消毒池需要有充气设施。7.充气系统包括充气机、减压阀、管道设备等充气机：罗茨鼓风机、空气压缩机或小型充气泵。空气过滤器：保持空气清洁，防止污染。充气管：供气管采用灰塑料硬管，池内充气管多采用塑料软管。微藻培养方法微藻培养方法（培养工艺流程）一、容器、工具的洗涤和消毒二、培养液的制备三、接种四、培养管理五、采收一、容器、工具的洗涤和消毒1.物理消毒法（1）加热消毒法直接灼烧：接种环、镊子等金属小工具，试管口，瓶口等。煮沸：小型的容器、工具。烘箱干燥：移液管、小型的三角烧瓶、试管等。高压灭菌：移液管、小型的三角烧瓶、试管等。（2）紫外线消毒法具杀菌力的波长：200-300nm,226-256nm杀菌力最强紫外线是利用紫外灯管进行的，这种方法对空气和物品表面消毒效果较好。紫外线消毒时间：20-30min2.化学消毒法在生产中，大型容器、工具及培养池一般用化学药品消毒。消毒前，先将容器工具洗刷干净。(1)酒精（乙醇，C2H5OH）：70%-75%酒精。(2)高锰酸钾（KMnO4）：浓度：按10-20mg/L的比例配成溶液小型容器、工具：浸泡5min。玻璃钢水槽和水泥池：淋洒池壁，泼洒池底。或池壁用抹布擦，池底用刷子刷。(3)石炭酸（苯酚，C6H6OH）：在3~5%石炭酸溶液浸泡30min。(4)盐酸（HCl）：在10%盐酸溶液中浸泡5~10min。适用于玻璃器皿的消毒，铁、铝、水泥池等不能用HCl消毒。(5)漂白粉（Ca(ClO)2）或漂白液（NaClO）：小型容器、工具：在1~5%漂白粉溶液中浸泡30min。玻璃钢水槽和水泥池：淋洒池壁，泼洒池底。或池壁用抹布擦，池底用刷子刷。注意：用上述化学药品消毒完毕，都要用消毒水冲洗2-4次。生产上一级培养容器的洗涤和消毒:三角烧瓶、细口瓶、矿泉水桶的消毒方法：先用洗洁精（或淡水）清洗内壁及外壁，除去附壁死藻。再用盐酸洗刷。隔一段时间后再用沸水冲洗至少3-5遍，至桶内没有盐酸的气味。用于包扎瓶口的纸（牛皮纸或报纸）：要放锅里蒸10min左右，达到消毒目的。用于包扎大白桶的塑料：用淡水（或涮完桶的煮沸海水）洗刷，去除附壁或沉底的死藻。然后折成方块放壶里煮沸后，再小火煮15min（消毒更彻底）。生产上二级培养容器的洗涤和消毒：洗涤方法：第一遍先用漂白液冲洗，第二遍擦洗，用抹布蘸漂白液将内壁擦洗一遍，等至少10min以后用刚烧开的水冲洗。生产上三级培养池子的洗涤与消毒：第一遍用消毒的海水冲洗池壁池沿,第二遍用漂白液清洗，池沿用抹布擦，池底用刷子刷，等至少10min以后再用消毒的海水冲洗一遍.充气管的消毒：用淡水或煮沸海水洗刷除去死藻（气石+管子）吸一下盐酸（工具：吸耳球）用淡水或煮沸海水吸一段时间（水要多，时间够长，保证把盐酸除尽）放锅里煮沸后，再小火煮15min。