蛋白质分离纯化chaer

蛋白质纯化技术

ProteinPurificationTechniques汤丽霞电子科技大学TextbookandReferences

教材：蛋白质纯化技术及应用

陆健化学工业出版社参考书目：生物化学实验技术何忠效化学工业出版社生物化学技术原理及应用赵永芳科学出版社………Exams

平时成绩（10％）：出勤+作业；期末考试（50％）：对已学知识掌握和综合运用能力的考察；实验成绩（40％）：动手能力+实验报告。48学时包括：授课（16学时）+

实验（32学时）OutlineChapterIProteinIsolation

蛋白质分离2学时

ChapterIIPurificationTechniques

纯化技术10学时ChapterIIIStrategiesforSpecialProteinPurification几类特殊蛋白质纯化策略4学时

Whydoproteinpurification?Togaininsight:研究蛋白质结构与功能基础

Foruseinmdicine：

Insulin（胰岛素）

BloodFactorVIII(hemophilia)Glucoseoxidaseandperoxidae(葡萄糖检测）

Foruseinindustry:biocatalysisHowtodo?NaturalsourceRecombinantsourceExpressionSamplepreparationChromatographicpurificationStorageStop?来源前期处理纯化蛋白质分离纯化过程AmmoniumsulfatefractionationCellOrganelleHomogenizationMacromoleculeNucleicacidCarbohydrate(Lipid)SizeChargePolarityAffinitySmallmoleculeCellDebrisProteinAminoacid,Sugar,Nucleotides,etcGelfiltration,SDS-PAGE,UltrafiltrationIonexchange,Chromatofocusing,Disc-PAGE,IsoelectricfocusingReversephasechromatography,HIC,Salting-outAffinitychromatography,HydroxyapatiteJuangRH(2004)BCbasics材料选择与处理粗分级细分级根据需求设定方案Functionalstudies

MassSpectroscopyAntigenforimmunizationStructuralstudiespgngμgmgmoderate>80%high>95-99%proteinamountrequired;purityrequirement尽量遵循以下原则：Asfewstepsaspossible（步骤尽量少）Asshortatimeaspossible（时间尽量短）LowTemperature:tokeepactivity（保持活性）Purificationisatoughtask1、生物材料的组成极其复杂木瓜蛋白酶(papain)Purificationisatoughtask2、目的蛋白含量极微，只达万分之一，几十万分之一甚至百万分之一。生长素释放抑制素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg50万只羊脑基因工程9升大肠杆菌培养液蛋白质纯化好比爬山材料选择及处理细胞破碎及分离ChapterI：ProteinIsolation

1.1材料选择及处理

材料的来源：动物、植物和微生物选材的基本原则：有效成分含量高、稳定性好；来源丰富、易保鲜；提取工艺简单、成本低等。材料处理：动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分；植物要先去壳、除脂；微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。材料选取有效成分含量高的部分主要存在于番木瓜的根、茎、叶和果实中,以未成熟的果实乳汁中含量最高。木瓜蛋白酶体外郊重组姓表达诱导表达及纯化获取岁蛋白估的主讯要来香源之贵一构建您表达菊载体1.都2细胞偏破碎递和提祝取细胞御破碎：Th瞎e恳fi勇rs世t垦st妖ep锣i焰n忘t溪he椒p火ur槽if框ic窜at松io狮n旷of脾m变os喉t惯pr家ot果ei抵ns掉i赖s黄to晨d礼is秆ru鼻pt胀t显is灭su将es池a挑nd俩c络el港ls吸i岭n手a漏co爪nt誉ro粘ll额ed兴f搁as悠hi椒on扶.细胞丧破碎抬方法研磨愉法高速列匀浆超声暂破碎遍法压榨冻融表面督活性沟剂或脂象溶性们溶剂酶法机械忠法化学贯法生物建化学仙法物理想法细胞嫩破碎停方法研磨喇法：一种愚机械革破碎驱细胞花法适用奴于动蚊物组福织，愧细菌勿和植永物加入贸石英慢砂或历经液蛮氮处骄理以薪提高华效率鸣。高速趣珠磨细胞且破碎应方法超声炭破碎罩法：借助猛超声仇波的可振动疮力破圣碎细今胞。适用色于微露生物恼材料,破碎套效果匪与菌体矿浓度闹、超矮声频慌率以及碧时间亡有关航。此法互的缺婆点是晶在处类理过至程中寒会产生宗大量小的热小。细胞俊破碎尝方法压榨疏法：压榨缎是一滚种温衬和的勿、彻底羊破碎占细胞蝴的方糟法。缺点彼是仪珠器费宅用较边高。细胞迈破碎薪方法化学久法：脂溶啄性溶丧剂或SD绘S(十二豆烷基迟磺酸劳钠)等表编面活敌性剂书处理灰细胞葛，可素将细把胞膜矮溶解砌，从渠而使当细胞齿破裂扯。Fr领ac笼ti魄on券at及io宜n（分置离）:Ce种nt春ri戏fu共ga宫ti侨onis践t卵he哭m嘱os华t役wi杯de怠ly排u箭se溜d毕pr盟oc数ed逐ur翁e炉to活s继ep扮ar版at炒e联th椅e两ho迹mo灯ge向na员te温i爽nt塞o井di敬ff雄er旁en赔t骂pa芳rt市s,旅o括r耽fr哄ac遭ti掌on澡s.离心幕机固定角转子F=榨Mω2r悬浮喂式转伙子（荷水平灶转子丸）沉降斜系数讨（se闪di铲me番nt切at亿io辩n筑co谣ef呢fi气ci宪en裁t）沉降撑系数：即揪生物互大分扫子在送离心碌力场答的作用洽下，缩慧从静端止状涌态到饰达极炉限速滑度所光需要载的时吉间。象生物份大分催子在凯离心醒时，羽其分铲子量弹、密而度、畜形状棍等均闸对其厉沉降握速度取有影周响。袍沉降既系数梯就是事用来枯描述敢此沉汗降性来质的猾。生物佛大分姑子沉样降时间通常鸡为1～20奔0×窗10-1因3秒范笛围；S=崖10-1果3秒Ch祸ap物te计r宜I小结对蛋售白质绑纯化仗过程从大概筐了解细胞尺破碎泉方法赵（重薪点）沉降侍系数连（理陕解掌币握）补充勿一：遣确定织目标可蛋白剖检测皂手段De椅te铸ct忠io辽n亡an圈dqu且an电ti据ta坝ti司onof疤t穷ar呆ge疤ti拍ng引p膜ro鞭te冈inTh卸e捧as趟sa凝y恢sh购ou款ld赴b陷e:Sp爬ec通if振ic呜:专一Qu殿an汗ti辩ta侄ti制ve置:定量Ec盾on幼om骄ic轨al雹i来n刮te攻rm原s河of浇t桶im砖e肾an乒d上ma科te遗ri壮al：简厘便经返济补充造二：Bu缓ff萄er岗p辞re王pa喝ra扶ti编on(缓冲禁液配交制）Bu悟ff农er酱s绵ar软e宏so叫lu梦ti鼠on富s识of型w短ea碧k股ac侦id惕s拥or肃b男as伏es躬a灰nd枯t体he盲irsa席lt钓(s),效w厌hi观ch里r悬es蜜is见t弟ch顺an成ge粘s侮in雾p巨H.Bu血ff客er鹊p艺re感pa贼ra深ti笼onpK堪a值:该基毙团在狼此pH一半蚊解离Henderson-Hasselbalch方程pH=pKa+lg[质子受体][质子供体]缓冲宾液有绍效缓兼冲范杨围为PK沟a±稼1p惊H以醋巧酸缓俭冲液吃为例亭（CH3CO骑OH租/C胁H3CO秆ON柄a）Bu起ff谨er须r稻eg外io至nQ:堂Co讨ul丧d换th报e苗re绍qu景ir费ed速m苍ix辜tu蓬re金o按f煮CH3CO警OH袄a辱nd帽C匠H3CO破ON贸a帐be鞠m朋ad猴e魂by受t梅it凶ra怠ti蜡ng阵a候s盏ol猫ut裹io丘n魄of免C咏H3CO此ON皆a丘to茎t卸he眨c非or侨re份ct挠p筹H巨wi漠thHC念l?Noac约id跳+冬b判as爱e寇=sa票lt+更wa持te逼ra筛bu键ff棉er植=玩(赞ac花id语+供i挪ts两s降al奇t但)戴or司(邪ba蠢se榆+谦i慨ts守s散al汤t)Q:Co勇ul软d品th粮e突re代qu甲ir欧ed答m勿ix转tu多re葛o信f鹊CH摩3C棵OO蹦H必an攀d泻CH侮3C采OO便Na会b节e属ma垒de沈b织y娱ti勤tr猜at而in做g幕a驻so邻lu玩ti番on扩o辞f沈CH柱3C细OO渗H改wi沸thNa家OH?Ye恶s!No握b制y专pr好od绝uc孔t驰pr陪od单uc形ed宴(没有科副产捞物生仰成）缓冲液分子量pKa值缓冲范围Tris121.18.087.1-8.9HEPES238.37.477.2-8.2MOPS209.37.156.6-7.8PIPES304.36.766.2-7.3MES195.26.095.4-6.8常用绣缓冲盖液的pK朋a值Tr股is：三西羟甲投基氨像基甲皂烷；HE电PE寻S：n-伏2-羟乙哲基哌候嗪-n族’-念2-乙磷杜酸；MO豪PS：3-（n-吗啉锤代）钟丙磺荷酸；PI射PE泻S：n，n’谦-双（2-乙磺次酸）仇哌嗪辰；ME藏S：2-（n-吗啉勿代）食乙磺级酸。Ad殖d贪so躲me午o俯th砌er较c或om弊p