江南大学开题报告

直博工作汇报

汇报人：李蓓个人简介：2003年7月毕业于河南师范大学生命科学学院生物技术专业，同年9月开始攻读山东大学生命科学学院细胞生物学专业硕士，师从张举仁教授，研究方向为植物细胞工程与基因工程。目前已修完硕士研究生培养方案规定的课程，成绩优秀。

此外，选修了基因组学与蛋白质组学专题、分子细胞生物学进展、细胞分化等博士生课程；阅读了《植物分子遗传学》、《从基因到基因组》等专业书目，在理论水平上有一定提高；除课程学习、实验室研究工作正常进行之外，还大量阅读与专业有关的各类文献资料，思路方面有了一定的扩展。

已经熟练掌握了农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化技术；掌握了质粒重组、DNA和RNA的提取、PCR及SDS等分子生物学技术。从黑豆及荷豆2#中克隆了hsp热诱导启动子，并进行了功能验证。参与重组酶FLP的克隆和重组酶作用位点frt的构建，并将它们构建入植物表达载体，转化烟草进行了功能验证。下一阶段的工作计划和目标利用FLP/frt系统去除转基因玉米的选择标记及耐盐相关基因的聚合实验目的：利用FLP/frt定点重组系统，获得去除选择标记基因的玉米转基因植株；

利用二次转化或者有性杂交的方法获得去除选择标记基因的基因聚合植株；探索高效获得无选择标记基因植株的途径与方法。实验背景：选择标记基因被广泛的用于植物转基因中转化子的筛选工作，目前最常用到的选择标记基因大多数为抗性标记基因(resistantmarkergene)。随着转基因植物的商品化种植，抗性标记基因在生态环境和食用方面潜在的安全性隐患就成为颇有争议且悬而未决的问题，因此培育无抗性标记基因的转基因植物已成为基因工程育种的重要目标。完全避免使用抗性标记基因使用安全性标记基因获得转基因阳性植株后将抗性选择标记基因除去共转化系统(Co-transformationsystem)以转座元件为基础的系统(Transposableelement-basedsystem)同源重组系统(Homologousrecombination)染色体内部的重组系统(Intrachromosomalrecombinationsystem)位点特异性重组系统(Site-specificrecombinationsystem)

在植物基因工程中常用的位点特异性重组系统主要有以下几种：来自于噬菌体P1的Cre/lox系统来自于酿酒酵母的2µm质粒中的FLP/frt系统来自于接合糖酵母Zymosaccharomycesrouxxi的pSR1质粒的R-RS系统来自于Mu噬菌体的Gin重组酶系统

FLP-frt定点重组系统来自于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2µm质粒。

该系统包括：FLP重组酶(FLPrecombinase)frt(FLPrecombinationtarget)重组酶作用位点

FLP酶催化frt位点间的特异性重组：根据frt位点

位置和方向的不同，催化DNA片段的倒位、切除和整合。

1993年，Lyznik等利用FLP酶的瞬时表达系统，以玉米和水稻的原生质体为材料首次证明了FLP/frt系统在植物中的定点重组功能。1994年，Lloyed和Davies通过对烟草稳定转化体的研究验证了FLP/frt系统的功能。1996年，Lyznik等通过对玉米愈伤组织的研究也证明了该系统的功能。2000年，HongLuo等利用FLP/frt重组系统从雄性不育的转基因拟南芥植株中获得了育性恢复的植株，表明该系统可为杂交种或杂交植物的获得提供一条可供选择的途径。工作基础：已构建植物表达载体：pCAMBIA1300-35S-flp-hptpCAMBIA1300-35S-antiport-frt1-als-frt2pCAMBIA1300-35S-CDH-frt1-als-frt2

pCAMBIA1300-35S-hsp1-flp-hptpCAMBIA1300-35S-hsp2-flp-hpt已构建原核表达载体：pET-42-b(+)-FLP图为含有重组酶FLP基因的植物表达载体pCAMBIA1300-FLP图为选择标记基因两侧带有同向frt位点的植物表达载体Fi晒g.差E母nz练ym喂e槐di捡ge垄st占ed精c机ha妻ra旋ct抚er营iz财at朋io窗n关ofpC崭AM禁BI拔A1艘30肝0-宵an肝ti数po快rt愈-f斯rt狱1-删al供s-征fr劲t21,开p贺CA科MB红IA钱13明00锦-a月nt旁ip遵or草t-冷fr苍t1猫-a犁ls未-f宝rt武2/Xb凭aⅠ2,踢p魄CA剧MB据IA钓13垒00办-a袭nt文ip冻or岁t-闷fr迎t1蛋-a笨ls肝-f声rt抬2/Ba国mHⅠ3,pC佳AM摇BI束A1庄30宪0-扫cd波h缩慧-f粮rt顽1-遵al涌s-便fr摆t2棒/Ba蹲mHⅠ4,pC唐AM然BI滑A1在30方0-肿an方ti乘po喘rt毙-f痕rt育1-雹al厨s-店fr咏t2休/Xh岔oⅠ5,pC溜AM疑BI匹A1悉30梳0-宁an单ti柴po经rt狭-f危rt旱1-央al能s-指fr鸽t2迅/Ec灰oRⅠ6,λ/荡Ec罪oT晌14纲;棒7逐,纵DL改20翼00Fi眼g.睬E武nz捕ym敌e炕di延ge袋st泻ed女c罗ha温ra逃ct茄er讯iz些at环io膨nofpC翁AM裂BI帮A1自30倍0-椅fl醋p-汁hp屈t1,pC中AM丹BI纹A1仇30绣0-吐fl脆p-街hp星t/捡Hi皮ndⅢ2,伐p吐CA起MB贪IA拿13障00麦-f处lp请-h垦pt宁/E敏co读RⅠ3,府p利CA忙MB服IA莫13肆00桐-f之lp秩-h齐pt孔/B怨am亦HⅠ+K条pnⅠ4,琴D符L2尼00世0其中，pC兴AM崭BI墨A1直30暴0-怒35验S-购fl预p-课hp糊t、缎pC净AM赵BI竹A1疫30绸0-3驳5S毅-a艳nt赵ip猛or版t-哭fr历t1-a稼ls案-f窃rt2以及pC奇AM饰BI如A1啦30今0-饿35灰S-停CD拿H-燃fr照t1-a羡ls赢-f倾rt2三种把植物框表达残载体闷已经筛转化影烟草它并且煮得到时了阳矿性植职株；通过教二次专转化示和共交转化扰的方报法在飞烟草款中鉴愚定了FL揉P/fr阳t定点姻重组符系统圈的功宰能，炮得到披了去晃除选趣择标症记基因效仅带热目的晓基因秧的烟探草植充株状；Fig:PCRassayforantiport

ofthetransgenictobaccoplantlets1,resultfromplasmidDNA;2,3,transgenicplants;4,untransformedplant;5,DL2000

Fig:PCRassayforFLP

ofthetransgenictobaccoplantlets1,untransformedplant;2,DL2000;3-8,transgenicplants;9,resultfromplasmidDNA.Fig1:PCRassayforantiportoftheco-transgenictobaccoplantlets1,DL2000;2,resultfromplasmidDNA,3,4,untransformedplant;5-7,co-transgenicplants.Fig2:PCRassayforFLPoftheco-transgenictobaccoplantlets1,resultfromplasmidDNA;2,co-transgenicplants;3,DL20004,untransformedplant.Fig3:PCRassayforoftheco-transgenictobaccoplantlets1,co-transgenicplants;2,untransformedplant;3,resultfromplasmidDNA4,DL2000

将pE汉T-茧42适-b消(+馒)-趣FL布P原核款表达守载体弄转入E.co待li的DE窑3(菜BL乳21疏)株系虾中并印进行烧表达骨，通蓝过SD瞎S-水PA浮GE电泳参得到散了表薪达的FL掀P重组理酶的48KD锋a的目点的条袖带。工作乡丰计划以：构建植物绕表达扫载体:pC康AM昌BI狂A1票30觉0-Ub西iq路ut盏in-f搭lp嘉-b胳ar奏(U们FB货)pC额AM仓BI匪A1挡30窗0-Ac鼓ti献n-an晶ti楼po刊rt-f修rt1-al孙s-辜fr卷t2(A类AF留A)pC运AM表BI滥A1送30袜0-Ub羊iq羽ut伙in-P福Pa雀se调-f润rt1-a耀ls炊-f糠rt2(U溪PF片A)转化昂玉米灯芽尖励及愈非伤组乏织，血成苗薯后经烤分子景生物河学检摊测得斯到转季基因块阳性贤植株芝，然躁后通辨过二仓次转闪化或夹有性散杂交菊的方测法获得昆去除骨选择标记订基因谜的玉躲米转吊基因吗阳性帝植株奏。农杆菌介导的玉米芽尖和愈伤组织的遗传转化获得转化植株

PCR检测AAFA阳性植株UFB阳性植株UPFA阳性植株有性杂交自交有性杂交AT1FT1PT1PCR检测PCR检测去除选择标记基因的去除选择标记基因的阳性植株进行Southern阳性植株进行SouthernNorthernblot检测Northernblot检测去除围选择新标记卵基因帖的基运因聚境合玉偿米植洲株的融获得盐：在获仅得去慎除选缩慧择标情记基因位的转逼单基润因的体阳性午植往株基爹础上偏，使礼带有处单吼基因熟的植闪株之喜间进孝行有浑性狡杂交膜，筛袍选后殊代以必获六得基岭因聚秘合的么阳性旁植株喇；AT1阳性植株x

PT1阳性植株APT2PCR检测对去除选择标记基因而含有两种目的基因的阳性植株进行SouthernNorthernblot检测在得抚到转较单基驳因的勺阳性清植株蜡基础贞之上系，进申行二直次转答化或秘者有汉性杂校交，矿对其斥后代朱进行番分子裁生物辽学检键测，胶得到膝含有峡两个骨目的施基因积的阳骡性植眠株，福将其堵与含垫有FL哈P重组带酶的禾阳性暗植株办进行舍有性黑杂交悬，经薄过检旗测可耐以得台到去票除选枯择标肚记基杜因的堵基因摘聚合这植株瞧；AAFA阳性植株xUPFA阳性植株APT1PCR检测含有两种目的基因的阳性植株SouthernNorthernblot检测PCR检测对去除选择标记基因而含有两种目的基因的阳性植株进行SouthernNorthernblot检测

xFT1在获背得去别除选谨择标蛙记基币因的缸转单售基因辛的阳拾性植蓬株后疾，利故用二蚊次转痕化或增有性鲜杂交掩的方载法将位第二弊个目学的基此因(基其选猛择标巷记基垮因的哗两侧必带有作同向超的fr浪t位点笛)导塑入，酬在原浴阳性药植株乞中的FL冻P重组旋酶的夕作用蓬下将浮带有仇第二胜个目效的基册因的邀表达其载体滥中的乐选择杯标记惰基因睛去除姨，同窑时实摧现目炎的基即因的分聚合染。PT1阳性植株xAAFA阳性植株(AT1阳性植株)(UPFA阳性植株)APT2'PCR检测对去除选择标记基因而含有两种目的基因的阳性植株进行SouthernNorthernblot检测构建植物螺表达昆载体:pC厅AM壶BI跨A1搁30竟0-hs授p-f堵lp丘-b或ar转化罚玉米度芽尖肠及愈筐伤组厉织，锤成苗扰后经济分子假生物扰学检哄测得杂到转翠基因盛阳性宽植株数，通硬过在奏不同爽时期红，不界同温过度条泊件下体对植贴株的浩不同远部位活进行裳热激冬，诱耗导由孤热诱驰导启槽动子兔启动隙的重沸组酶FL施P的表盆达，检测嫂该酶骂的表鸽达水猴平，准以确呢定诱伟导重嚼组酶触表达锈的最野佳条栗件。探索坏重组村酶作长用位煌点fr系t的长示度及允串联环个数保对重称组宁效率瓣的影洒响：构建注不同则长度臭的位猛点序介列的兼两串降联重寺复和众三串么联刚重复歌：fr锅t1:78架bpfr题t2:78个bpfr少t1:96菠bpfr让t2:96唇bpfr唉t1:11未7b度pfr铲t2:14房诚4b停p将这饮些成誉对的毯位点守序列阳置于应需要滤删除粥的基把因两积侧，答重组响质粒滨后转愁入E.co箩li，提取这质粒雀鉴定仓后，杜将质邮粒与纯化燃的FL宾P重组鹊酶共同惠孵育监，检抱测重雕组事碎件是格否发甘生。一点肚设想洽：在获瓣得去景除选舟择标盖记基纹因的旗转单升基因瞒的阳葡性幅植株A基础茧上，推构建蔬带有吹不同活目的青基因志的植俩物表蝴达载监体B，使B仅在估目的摄基因愉的一旨侧带蔑有单谋一fr韵t位点幅，然欢后用做植物捉表达迹载体B对A进行柿二次意转化磁，期盛望A中的FL宝P重组撒酶仍喇然发划挥作抹用，像催化雕两个fr蓬t位点梅之间蛾的重纹组。逃经过叫检测终，也盏许可具以拿展到含润有两汇个目杨的基捉因，烫而不妨含标化记基象因的桃阳性脊植株茎。请各器位老议师批岛评指趋正！酿酒接酵母姜中广糖泛存绝在的数2μ环是猛双链萄环状长的DN冰A质粒畅,其农结构妇上最伯为显晃著的煎特点同是存淹在两酒个5思99bp的反奋向重脱复序意列(IR历)。这两栏个IR序列拿之间尽容易熊发生寇重组夸,使科2μ环在香酵母伐细胞鉴中存叫在A和B两种济不同踪蝶的构居型,植并且肠对于享2μ环在喊酵母相细胞制中维劳持高葛拷贝彼数具秒有十嗽分重脖要的采作用工。2μ环分踩子内抵发生脱的DN慎A重组估属于痛位点孙特异貌性重倍组,扰由2μ环自智身编尼码的FL施P重组雪酶催亮化。FL约P重组衫酶作院用的叉靶序叹列为娃2μ环的秤两个IR序列败中4蒜8bp的FR须T位点翠,FR颗T位点厘由3拴个1于3bp的FL恩P重组漫酶结侮合区极和一符个跨住越Xb惧aI位点廊的8bp间隔膜区所将组成基。FL虫P重组谋酶可关以介屋导三袖种类耳型的DN宵A重组发反应滨:当两拿个FR缎T位点塘位于赌同一病条DN巡寿A分子颈上,乒且为厚顺向寄排列蓝时,资重组税的结胞果会完导致糕两个FR燥T位点妈之间届的DN榨A片段贪被切两离;当两姻个FR缠T位点银反向锯排列底时,如重组授的结胳果则爪导致盟两个FR璃T位点牺之间布的DN悬A片段动发生绞倒位填;当两雕个FR镜T位点滋分别耐位于辣两条DN虑A分子仍上时摩,重痛组的猴结果晃则导宗致DN挑A发生见相互集易位尽。Th姿e俱pr烛in漫ci纷pl永e练of饰C刺o-汉tr时an挂sf千or将ma劈燕ti反onA桌pr度op虏or拖ti脾on弄o愈f角t抖ra号ns尾fo朗rm枯ed义p听la李nt搅sca俭rr嫌yi肯ng徒t送he判s椅el尊ec饥ta哑bl感e洞ma温rk们er反g凯en墓e闭wi灵llal药so骂h薄av所e捉in宋te智gr衫at煮ed器t岁he体r慨eq莲ui卡re饱d么in屡te羡re昌stge镇ne呆a公t搭a戏se熟co良nd渡u贡nl蓬in躲ke改d共in凑se忌rt辣io神n革si烧te若.Ma矩rk墙er恋g勺en闸es磨c冈an漆b秃e捷re找mo苦ve没d倾byge尸ne幕ti蛾c黄s忧eg章re迁ga底ti意on冤.ShortageTheco-transformedsystemCannotbeusedforvegetativelypropagatedplantsCannotbeusedforplantswithlonggenerationtimesTimeconsumingTh登e列st躲ra前te俯gy编o妄f周tr拔an棍sp麦os姻ab指le总e晨le捷me松nt冈-b其as辰ed揉s取ys供te闯mCo晚nn事ec乘ti居ng转e少it穗he篮r外th挡e贸in咱te杂re景st类g杏en罪e之or许t竿he的s窜el恰ec宽ta供bl狱e饺ma阻rk罗er短w驱it园h送tr越an庄sp省os论ab厅le歇s眉eq属ue刃nc县es弄i滋n挽su肉ch仅a俗w抄ay询t暂ha保t厅th昏e赖tw喝o横en匀ti滑ti疯es推c秘an沈b夸e含se瞎pa炎ra健te户d仆fr塌om划e疲ac烧h固ot晒he茄r番in暑a咏c盼on赔tr吗ol忽le哀d淘re俘ac爬ti纹on谁a旱ft赠er什t切ra仿ns炎fo瞒rm厉at振io候n深an录d挑se各le艳ct消io蒜n.Ma尺rk走er躲g貌en垫es耀c主an河b窗e阴re茧mo疫ve湖d浆by垮g埋en鸭et讯ic雅se妄gr裙eg乐at玻io榨n.Di薪sa责dv竹an穗ta险geLo乎w替fr授eq缺ue讨nc尸yTh诵e刊lo贤w丑fr叶eq快ue咐nc削ie腰s项pa俊rt型ly蜡d雷ue么t泛o眼th氏e餐te帐nd览en鬼cy纹o忙ftr后an悲sp埋os姨ab旷le毛e们le教me绑nt血s向to垃r纳ei霉ns竹er无t员el纵se贡wh挎er荣e耀in马t道he高g尚en灰om绿e.Ge金no鲁mi昂c逼in府st捞ab归il租it嚷yEx财ci链si责on拳o讲ftr维an至sp叉os赌on湾sis晨f确re沸qu搏en鲁tl链y堆im御pr代ec喉is恳eRe妄pe煮at已ed忽c堪yc旧le钻s附