细菌的生理生化实验基本知识

第五章细菌的生理生化与血清学实验基本知识食品质量检测技术目前一页\总数三十六页\编于十七点一生理生化试验微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

目前二页\总数三十六页\编于十七点1．氧化型与发酵型(O／F)的测定

原理:

不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。微球菌、非发酵菌均阴性，葡萄球菌和肠杆菌科细菌均阳性

目前三页\总数三十六页\编于十七点2．糖类分解试验

不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性。指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。目前四页\总数三十六页\编于十七点糖酵解试验枸椽酸盐试验（－＋）目前五页\总数三十六页\编于十七点3.V-P试验

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。（－）阴性V-P试验阳性（＋）目前六页\总数三十六页\编于十七点4.甲基红（MethylRed）试验

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。大肠杆菌：MR+/VP-目前七页\总数三十六页\编于十七点某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物5、吲哚(靛基质)试验

目前八页\总数三十六页\编于十七点尿素酶试验6.尿素酶（Urease）试验

有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。目前九页\总数三十六页\编于十七点7.氧化酶（Oxidase）试验

氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。目前十页\总数三十六页\编于十七点8.硫化氢（H2S）试验

有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。目前十一页\总数三十六页\编于十七点9.枸椽酸盐试验：某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色目前十二页\总数三十六页\编于十七点

10、触酶试验

原理

:本试验是检测细菌有无触酶的存在。过氧化氢的形成看作是糖需氧.分解的氧化终末产物，因为H202的存在对细菌是有毒性的，细菌产生酶将其分解，这些酶为触酶(过氧化氢酶)和过氧化物酶。

试剂

3％H202(新配)。

试验方法:可用接种环将一菌落放于载玻片的中央，加l滴3％H202于菌落上，立即观察有无气泡出现，也可在菌落和H202混合物之上放一张盖玻片，可帮助检出轻度反应，还可降低细胞的气溶胶颗粒的形成。或直接将3％H202加到培养琼脂斜面或平板上直接观察有无气泡出现目前十三页\总数三十六页\编于十七点

11．淀粉水解试验

原理:

有的细菌具有淀粉酶，能水解培养基中的淀粉成麦芽糖。淀粉水解后遇碘液不再呈蓝紫色反应。

试验方法:

将细菌划线接种于3％可溶性淀粉琼脂平板上，在37度培养24h。取出平板，在菌落处滴加碘液少许，观察。培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环(即淀粉酶阳性)。

目前十四页\总数三十六页\编于十七点12．石蕊牛乳试验

原理

石蕊是一种pH指示剂，当pH升至8．3时碱性显蓝色，pH降至4．5时酸性显红色；pH接近中性，未接种的培养基为紫蓝色故称紫乳。石蕊也是一种氧化还原指示剂，可以还原为白色，所以，石蕊牛乳(紫乳)是用来测定被检细菌几种代谢性质的一种鉴别培养基。

目前十五页\总数三十六页\编于十七点

13．苯丙氨酸脱氨酶试验

原理

若细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色。变形杆菌和普罗菲登斯菌以及莫拉氏菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。

目前十六页\总数三十六页\编于十七点

14．氨基酸脱羧酶试验

原理

这是肠杆菌科细菌的鉴别试验，用以区分沙门氏菌(通常为阳性)和枸橼酸杆菌(通常为阴性)，若细菌能从赖氨酸或鸟氨酸脱去羧基(一CIX)H)，导致培养基pH变碱，指示剂溴麝香草酚蓝就显示出蓝色，试验结果为阳性。若细菌不脱羧，培养基不变则为黄色。

目前十七页\总数三十六页\编于十七点

15．胆汁溶解试验

原理

肺炎链球菌产生自溶酶，它能使正在生长的菌体溶解，使老龄菌落中心下陷，胆盐通过降低培养基与菌体细胞膜之间的表面张力而加速这一过程。本试验常用以鉴别肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌。

目前十八页\总数三十六页\编于十七点

16、明胶液化试验

原理

明胶是一种动物蛋白质，某些细菌具有明胶液化酶，明胶经分解后，可呈现不同的特征，有利于细菌的鉴定。

目前十九页\总数三十六页\编于十七点

17、β－半乳糖苷(ONPG)试验

原理

细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是β—半乳糖苷透性酶(β-galactosidasepermease)，它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗入细胞。另一种为β-半乳糖苷酶(β-gaalac-tosidase)，亦称乳糖酶(Lactase)，位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌，能在24—48h发酵乳糖，而缺乏这两种酶的细菌，不能分解乳糖。如有β-半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。

目前二十页\总数三十六页\编于十七点无动力有动力动力试验采用半固体培养基穿刺培养检测微生物是否有鞭毛的试验目前二十一页\总数三十六页\编于十七点三糖铁（TSI）琼脂试验和二糖铁（ＫＩＡ）琼脂试验原理：用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖10：10：1。只能利用葡萄糖的细菌，故使斜面后来又变红，所以仍保持黄色。发酵乳糖的细菌(e.coli)，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，某些细菌生成硫化氢和铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。目前二十二页\总数三十六页\编于十七点KIA克氏双糖铁琼脂照片E.coli目前二十三页\总数三十六页\编于十七点目前二十四页\总数三十六页\编于十七点硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验

试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。目前二十五页\总数三十六页\编于十七点二、血清学试验

血清学反应：是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。目前二十六页\总数三十六页\编于十七点１.血清学反应的一般特点：特异性阶段性比例性可逆性玻片凝集试验试管凝集试验抗球蛋白凝集试验补体结合试验ELISA试验琼脂扩散试验免疫荧光试验２.血清学诊断基本方法目前二十七页\总数三十六页\编于十七点１、凝集反应颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutinationreaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。１）直接凝集反应颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。目前二十八页\总数三十六页\编于十七点b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。２）间接凝集反应将可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在有电解质存在的条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应(Indirectagglutination)。载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应，敏感性很高。目前二十九页\总数三十六页\编于十七点目前三十页\总数三十六页\编于十七点２、沉淀反应可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。１）环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。

目前三十一页\总数三十六页\编于十七点２）絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。３）琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。目前三十二页\总数三十六页\编于十七点３、补体结合反应补体结合反应(Complementfixationreaction)是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象，如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，整个试验需要有补体、待检系统（已知抗体或抗原、未知抗原或抗体）及指示系统（绵羊细胞和溶血素）五种成份参加。如果出现溶菌，是补体与待检系统结合的结果，说明抗原抗体是相对应的，如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应。目前三十三页\总数三十六页\编于十七点微生物鉴定新技术ELISA法的种类:1.间接法检测抗体2.抗原竞争法检测抗原3.双抗体夹心法测抗原目前三十四页\总数三十六页\编于十七点双抗体夹心法测抗原的步骤：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗