实验室病原微生物危害评估报告(同名3479)

综合实验室质量管理体系文件实验室病原微生物危害评估报告第1版生效日期：2016年08月02日XX市疾病预防控制中心综合实验室目录第一章综合实验室实验活动生物危害评估报告 （2）冰箱、冷冻柜、水浴和离心机应该定期清洗和消毒（时间由实验室主任来决定），在发生严重污染后应立即进行清洗和消毒。进行清洗、消毒时要戴上手套，穿上工作服或其它合适的防护服。（3）外衣：外衣（实验服、工作服、和围裙）应悬挂在远离散热器、蒸汽管道、供暖装置、以及有明火的地方，不要挂在压缩气瓶或灭火器上，也不要挂在门的玻璃隔板上，妨碍视线。“清洁”的和“非清洁”的个人防护服要分开存放。（4）垃圾处理：每天至少清理垃圾一次。（5）装饰：不得在电灯、灯座或仪器上进行装饰，更不要使用电子装饰物、蜡烛、圣诞树等有引起火灾危险的装饰品。（6）为便于清洁消毒，实验室内不应有织物装饰的用具或椅子。（7）个人物品：实验工作区不得存放个人物品，如钱包、外套、皮靴、咖啡杯、运动服、预包装的食品和药品等。（8）实验室内应配备应急设备，如应急洗眼装置，酒精等消毒用品。（9）实验室应安装非手触式洗手装置。（10）实验室内应安装防蚊蝇装置，应定期投撒灭蟑螂、老鼠的药物。（11）用后的废弃物品：实验工作区内的用后废弃物品存量不要太大。具危险性的液体如酸或碱性液体应放在视平线以下。较大的废弃物容器应靠近地面存放。（12）出口通路：实验室的出口和通道必须保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置、或设备。安全门必须保持畅通，不得堵塞。注意：无论任何时间、何种原因都不得阻塞通往灭火器、火警箱、防火毯、安全淋浴或出口的道路。14.使用玻璃器具的危害评估及防护操作玻璃器具时应遵循下述安全规则：（1）不使用破裂或有缺口的玻璃器具。（2）不要用猛力取下玻璃试管上的塞子，粘紧的试管可用刀切开分离。（3）接触过传染性物的玻璃器具，清洗之前，应先行消毒。（4）破裂的玻璃器具和玻璃碎片应丢弃在有专门标记的、单独的、不易刺破的容器里。（5）高热操作玻璃器具时应戴隔热手套。（6）在不影响实验质量的前提下，应尽量减少使用玻璃器具。15.使用离心机的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤极少粘膜（眼结膜）可能呼吸道可能消化道（经手-口）极少经血（针刺伤、切割伤）极少经血（虫媒介）极少（1）气溶胶：离心过程中应控制气溶胶的产生在最低水平。（2）操作：离心机只有在盖好盖板后，才能启动。（3）传染性物品：所有能够产生气溶胶进行播散的生物制品或标本，都应使用密封的离心管，并在盖紧的离心头或转头中进行。（4）为防止气溶胶飞溢，应在离心停止30分钟后打开离心物。（5）清洗：按照消毒隔离制度要求清洗离心机。（6）平衡：离心时应保持合适的平衡，以保证离心的顺利进行。16．采集血样的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤极少粘膜（眼结膜）极少呼吸道可能消化道（经手-口）极少经血（针刺伤、切割伤）可能经血（虫媒介）极少盗窃可能化学腐蚀极少放射无（1）每天早晨用500mg/L的”84”消毒液擦拭抽血台面及其它物表，并开紫外灯消毒至少30分钟，并做好记录。（2）工人每天早晨更换消毒液，包括浸泡锐器、止血带的消毒液和手消毒液。（3）工作人员必须穿工作服，戴好口罩、帽子、和手套。（4）使用合格的一次性用品。严禁使用包装破损，超过有效期的一次性用品。（5）严格执行无菌技术操作规程、静脉采血必须一人一针一管一巾一带。微量采血应做到一人一针一管一片，对每位病人操作前洗手或手消毒。（6）无菌物品如棉球需每天更换，开启后使用不得超过24小时。（7）工作人员需对锐器如采血针采取高度预防措施，用过的采血针需浸泡在含有消毒液的厚壁容器中。17.标本(血清、血浆、全血、尿)上检验分析仪检测过程的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤极少粘膜（眼结膜）可能呼吸道可能消化道（经手-口）极少经血（针刺伤、切割伤）极少经血（虫媒介）极少盗窃可能化学腐蚀无放射无（1）为了避免液滴和气溶胶和扩散，实验室仪器加样、加液，清洗等过程应在封闭罩内进行的。（2）实验中使后的比色盘，反应杯等废弃物应当收集在封闭的容器内，集中处置。（3）在每一步完成后应根据操作指南对对仪器进行消毒。血液、体液污染物表时，应立即消毒。（4）工作人员要戴手套进行操作。18.标本(血清、血浆、全血、尿、粪)手工检测过程的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤可能粘膜（眼结膜）可能呼吸道可能消化道（经手-口）可能经血（针刺伤、切割伤）可能经血（虫媒介）极少盗窃可能化学腐蚀可能放射无（1）每天早晨做好实验室的清洁消毒工作。（2）工作人员要戴口罩、手套进行操作。（3）实验中使用的竹签用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡。（4）废弃的标本连同试管、盖帽要用1000mg/L“84”消毒液浸泡，由工人统一清洁后进行无害化处理。（5）实验中使用的吸头、一次性塑料杯用后要用1000mg/L“84”消毒液浸泡。（6）标本污染物表时，应立即消毒。（7）离心时，发生试管破裂或标本溅出，由操作者负责用有效消毒剂对离心机内部进行及时消毒处置。19．微生物分离鉴定药敏试验及基因扩增试验活动的危害评估及防护感染途径危害评估感染途径危害评估感染途径危害评估皮肤可能粘膜（眼结膜）可能呼吸道可能消化道（经手-口）可能经血（针刺伤、切割伤）可能经血（虫媒介）可能盗窃可能化学腐蚀极少放射无（1）每天早晨开紫外灯消毒空气至少30分钟，同时做好各物表、仪器的清洁消毒工作。（2）实验人员要戴手套、帽子进行操作。当估计会出现微生物和危险物溅出时要戴好眼罩或面罩。（3）操作中使用的接种环、镊子等金属物品要在酒精灯火焰上烧灼灭菌。（4）可能产生致病性微生物气溶胶或出现溅出的操作如涂片、接种时，应在生物安全柜内操作，并使用个体防护设备。（5）实验室内的各种标本、菌种、培养基和其它废弃物在运出实验室前必须灭活（高压、浸泡），需运出实验室灭活的物品必须放在专用的密闭容器中。（6）操作过程中发生菌种污染物表时，应马上采取措施进行物表消毒。（7）当发生致病性微生物气溶胶污染时，应马上进行人员疏散，通知负责人到现场进行指导消毒。（8）对菌种的保存应严格遵守菌种保存制度，严禁擅自保存各种国家法定传染病菌株或毒株。（9）实验人员离开实验室前要去除手套，确认无污染或污染已排除，后方可洗手离去。（10）微生物、PCR实验室要设置纱窗、挡鼠板。三、特定实验活动危害评估见以下章节之各种病原体的危害评估四、工作人员素质本实验室共有技术人员10名，其中申请进入BSL-2实验室10名。硕士学位3名，5名曾经从事微生物学实验，5名曾经从事无菌实验室活动经历，10名技术人员学习过生物安全手册并通过定期培训及考核成绩合格，经体检无现患严重疾病，本实验室无其他患传染性疾病的技术人员，健康状态良好。五、评估结论本次评估本实验室共14项可能潜在危险的实验活动，在实验操作实验施过程中在无控制措施情况下可能产生的高危害度2项，中度12项，低度0项；对危害发生的可能性分析，实验危害较大可能发生的有0项，可能发生2项，较少可能发生12项；这些危害造成高度严重后果的2项，后果严重性中度的12项，后果严重性低度的0项。根据拟采取的预防控制措施后依然存在的残留风险为高度0项，中度0项，低度危害12项。评估：XX市疾病预防控制中心综合实验室评估人：审核：XX市疾病预防控制中心生物安全管理委员会审核人：2016年8月02日第二章结核分枝杆菌的生物危害评估报告结核病是由结核分枝杆菌（偶尔可由牛型或非洲型分枝杆菌）引起的一种细菌性疾病。结核病可累及全身各个器官，但以肺结核最为常见。该病具有传染性强，散播面广，不分地域均可发生。结核病可由呼吸道、消化道、皮肤等途径感染，但其主要传播途径是以空气为传播因子的呼吸道传染，而排菌的肺结核病人传染性更大，是传播感染的主要传染源。1.传播途径呼吸道感染（respiratortractinfection）是肺结核的主要传染途径（routesofinfection），飞沬传染（dropletinfection）为最常见的方式。传染源主要是排菌的肺结核患者（尤其是痰涂片阳性未经治疗者）。飞沬核（dropletnuclei）＜10μm时可被吸人呼吸道，健康人可因吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的带菌飞沫而受感染。2.危害程度分级微生物按其是否致病、致病力强弱、危害人体的严重性、传染性的大小、临近人群的抵抗力、有无免疫制剂和特效治疗药物等综合评价，可分为四个不同的危害等级。结核分枝杆菌属于3级危险。3级危险（对个体具有极大危害，对群体具有较大的危害性）：指有特殊危险的致病菌。感染后症状较重，并可能危及生命，或者缺乏有效的预防方法、发病后不易治疗的微生物。3.实验室感染的原因及预防（一）技术操作可能导致的感染及其预防措施。1.接种：应使用无弹力的铂丝接种环，结核菌接种后接种环火焰灭菌易崩散，酒精灯烧灼时要特别注意。2.混匀：吸管吸吹菌液时不要产生气泡，应沿容器壁排出。3.研磨：最好使用组织研磨器，乳钵易产生气溶胶。4.移液：吸管上端的棉花松紧要适度，吸液时要从管底吸取，吹出时要轻缓，不要全部吹净，以免产生气泡，形成气溶胶。5.开封：要避免压力和气流的急剧变化。6.离心：离心管套底垫要完好，使用匹配的管、套、离心头，加盖。7.注射：做好个人防护，正确使用注射器。8.搬运：室内移动要避免滑落，移出室外要有坚实密闭的外包装。（二）技术保障1.双人原则，不允许单人操作1、2类病原。2.入口处应有危险警示标识，并标明所操作的微生物的种类。3.培训考核上岗，掌握相关技术操作要领，熟悉规章制度，适应工作环境。4.完备的管理措施，技术操作规范。5.良好的工作行为可降低生物危害风险。4.实验室中的分枝杆菌及分枝杆菌气溶胶结核病实验室工作人员，在分枝杆菌检验过程中，会接触到各种潜在感染源标本和各种危险物，特别是许多操作易产生分枝杆菌气溶胶。含有结核分枝杆菌的微滴核（1-5微米）通过呼吸进入人体肺泡，可以黏附在肺泡内生长繁殖。因此，首先要对实验室中生物危险物产生的途径和存在的地点有充分的认识，以便明确生物安全防护的环节。(一)分枝杆菌存在的地点1、各种临床标本，通常是痰，胃或支气管灌洗液、脑脊液、尿液等。2、被污染的操作台、器械、仪器、试剂等。3、收集的结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌菌株等。4、细菌学实验室的部分区域。(二)产生分枝杆菌气溶胶1、实验室内可疑肺结核患者痰标本的采集。2、样本的制备和涂片的火焰固定。3、分离培养或接种培养物。4、用火焰烧灼接种环。5、使用移液器混合培养物。6、培养管或培养瓶中含有培养物的滴落物。7、溢出的分枝杆菌悬浮液。8、高速混合含有分枝杆菌的液体。9、转移液态培养物和上清液，或培养液、上清液的倾倒。10、离心过程中离心管的破碎。11、用做原代培养所需的组织匀浆。5.安全防护(一)严格遵守实验室安全操作规程，任何时侯都要警惕分枝杆菌气溶胶的产生。实验室的技术人员必须经过生物安全培训后方可上岗。(二)实验室应严格限制非实验人员进入，减少实验室内外交叉生物污染。完成实验工作离开实验室，要关好门窗。(三)进入实验室应避免携带非必需物品。(四)进入实验室，工作人员应穿着工作服，操作时应穿戴防护隔离衣、口罩、帽子和手套，长发者应将头发装束在帽子内。(五)实验过程中绝对禁止吸烟、饮食等，不要以手抚头面部等。(六)试验前须开启紫外线灯对实验室和操作区域进行照射消毒1小时以上；试验结束后，立即开启紫外灯进行照射消毒2小时以上。(七)任何试验的开始和结束后，操作人员要用70%酒精浸泡双手或仔细擦后，用清洁剂或清水洗净。(八)每次试验结束后，必须清理好实验台，并用70%酒精液或3-5%石炭酸擦洗实验台面。(九)实验室中的生物危险品要根据检查项目和性质不同，局限在相应的试验区间，不得随意将其带到其它的实验室。(十)实验室内任何微生物的样本，废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。6.安全保障(一)首先各级实验室应按等级要求完善实验设施，如简易安全柜内的抽气排风功能、紫外灯消毒功能，生物安全柜维护与除菌滤膜定期更换等。(二)实验室采集病人痰标本时应在户外进行，避免因病人咳漱造成室内气溶胶污染。(三)普通实验室应注意气流方向，实验过程中尽量避免强气流变化而产生气溶胶（如﹕涂片、染色过程中）。(四)细菌的分离培养、菌种开封、转种、研磨、稀释等操作，各级实验室均应在简易安全柜或生物安全柜中进行。(五)使用接种环进行操作时，接种环应在工作灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。(六)稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气溶胶。(七)使用注射器加样时，用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头，应直接放入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感染。(八)菌株库要设专人管理，并按照国家微生物菌毒种管理办法执行。(九)进行毒菌操作过程中，不要穿戴巳经污染的防护性手套触摸门柄、仪器或毒菌区以外区域，避免由于粗心扩大污染范围。(十)试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的试验器械和物品，能够高压消毒的必须高压消毒，不能进行高压消毒的设备、仪器，应使用有效的消毒剂擦洗后再以紫外灯近距离长时间消毒。(十一)实验中发生意外污染情况，应立即通知主管人员并做好处理污染物和相应区域的准备，不得擅自采用其它禁止的方法进行消毒处理。(十二)实验室主任应制定规章和程序，只有告知潜在风险并符合进入实验室特殊要求(如，经过免疫接种)的人，才能进入实验室。(十三)操作致病性微生物时，实验室入口处应贴有生物危险标志，并显示以下信息：有关病原、生物安全级别、免疫接种要求、研究人员姓名、电话号码、在实验室中必须佩带的个人防护设施、出实验室所要求的程序。(十四)实验室主任为实验室人员特别制定的标准操作程序或生物安全手册中，应包括生物安全程序。对于有特殊风险的人员，要求阅读并在工作及程序上遵照执行。(十五)实验室主任保证实验及其辅助人员接受适当的培训，包括和工作有关的可能存在的风险、防止暴露的必要措施和暴露评估程序。(十六)实验室所用任何个人防护装备应符合国家有关标准的要求。实验室应确保具备足够的有适当防护水平的清洁防护服供使用。还应穿戴其它的个人防护装备，如手套、防护镜、面具、头部面部保护罩等。(十七)处理样本的过程中易产生高危害气溶胶时，要求同时使用适当的个人防护装备、生物安全柜和/或其它物理防护设备。如可产生含生物因子的气溶胶，应在适当的生物安全柜中操作。(十八)实验用鞋应舒适，鞋底防滑。应用皮制或合成材料的不渗液体的鞋类。在从事可能出现漏出的工作时可穿一次性防水鞋套。在实验室的特殊区域（例如有防静电要求的区域）或BSL-3和BSL-4实验室要求使用专用鞋（例如一次性或橡胶靴子）。7.结核病实验室废物处理一、实验室废弃物处理的目的：(一)将操作、收集、运输、处理及处置废弃物的危险减至最小；(二)将实验室废弃物对环境的有害作用减至最小。二、实验室污物处理及消毒(一)实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用品，试验完成后，应在操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射消毒2小时以上，再经高压消毒后方可丢弃或焚烧。(二)可重复使用的实验用品及器材，完成实验后，应在操作台或实验区域内经紫外灯近距离照射消毒2小时以上后，再交有关人员进行高压消毒和煮沸洗刷。(三)实验用的试管、吸管、注射器，须装在加盖不漏的容器内，经高压灭菌后取出。(四)培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。不允许积存垃圾和实验室废弃物。已装满的容器应定期运走。在去污染或最终处置之前，应存放在指定的安全地方，通常在实验室区内。(五)实验室废弃物应置于适当的密封且防漏容器中安全运出实验室。有害气体、气溶胶、污水、废液应经适当的无害化处理后排放，应符合国家相关的要求。(六)实验过程中，如标本或含标本的前消化处理液被打翻污染了操作台或地面，应以吸满70%酒精的卫生纸覆盖污染区，15分钟以后卫生纸方可移去。(七)实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入公共排水系统，更不允许混入居民生活垃圾。8.意外事故的处理(一)如果发生意外，必须立即通知实验室主管人员，并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理，绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。(二)实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验工作进行紧急处理，更换被污染的实验服，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒或酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。(三)如果发生菌液溢出，含菌种的培养管破碎等，造成中、小面积污染，可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小时以上（其间适量加溶液防止干燥），再经紫外灯近距离（1米内）照射2小时以上；被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上，实验完成后再进行高压消毒处理。(四)如果发生气溶胶污染或大面积污染，应立即停止实验并关闭实验室，对污染区域进行紫外灯照射消毒过夜；第二天对污染区进行24小时封闭空气熏蒸消毒（乙醛消毒法﹕5ml乙醛＋2g高锰酸钾/m3空间）。(五)绝对禁止使用的事故处理方法﹕1.任何有可能造成污染面积扩大的去污方法，如使用70%乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的区域。2.直接用火焰对未经任何处理的污染地面、操作台、器械等进行烧灼处理。3.使用消毒效果未经证实的消毒剂进行消毒。4.使用低浓度的消毒剂和紫外灯进行短时间、长距离的照射。第三章金黄色葡萄球菌的生物危害评估报告1.生物学特性金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。2.危害程度分类根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。3.致病性和感染剂量金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，有报道目前出现越来越多的耐药菌株，MRSA即耐甲氧西林金黄色葡萄球，菌致病性也随着变强。4.暴露的潜在后果暴露后可能引起感染，菌量大时可使实验人员出现皮肤软组织感染、全身性感染、呼吸道感染、中毒、肠炎等。被感染后，成为传染源，可能对周围及环境造成污染，应及时得到治疗和控制。5.感染途径通过污染食品和水源经口传播，也可通过呼吸道和接触传播。6.微生物在环境中的稳定性葡萄球菌是无芽胞菌中抵抗力最强者，而干燥可达数月，加热80℃7.浓度和浓缩标本的容量一般样本检测。8.自然和易感人群宿主金黄色葡萄球菌常存在于鼻咽喉、下消化道、毛发和皮肤上，在人类和普通的动物都有存在。致病性依照宿主状状，卫生情况，皮肤和黏膜有否创伤而异。当宿主免疫力下降，皮肤黏膜有创伤或卫生情况不好是易感染，特别是老人和婴儿。9.实验操作活动巳有文献证明，金黄色葡萄球菌可造成实验人员化脓性和呼吸道感染，人类不是该菌在唯一传染源，在许多动物身上都存在该菌。这种病原体可以存在于受感染的人或动物的脓液，血液等多种体液中。通过污染食品和水源经口传播，和通过呼吸道和接触传播是该菌的主要传播方式，该菌也是引起院内感染的主要细菌之一。暴露在气溶胶中也可能引起感染。按照国家标准方法对样本（粪便、食品、水样）进行分离，培养，鉴定。建议采用BSL-2级水平的操作技术，防扩散设备和设施。一旦发生意外，按照本实验室的《意外事故应对方案和应急程序》进行处理。10.预防和治疗金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。目前疫苗还不可用于人类。该菌能对人体多部位的感染，所以跟据所致疾病的不同也应采取不同的治疗方案，主要是对症处理和针对病原治疗，大体用药可选用红霉素、新型青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素Ⅵ治疗。预防金黄色葡萄球菌感染，首先是要做好个人卫生，和加强餐饮和食品卫生的管理，及时发现带菌者，做好各种动物的管理工作，把能传播该菌的途径有效的控制好。11.工作人员素质卫生技术专业人员，并经过生物安全培训后获得上岗证书。12.评估结论该菌生物性状较稳定，但抗生素有滥用，也出现了不少的耐药株。该菌主通过污染食品和水源经口传播，也可通过呼吸道和接触传播，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。预防手段主要预防金黄色葡萄球菌感染，首先是要做好个人卫生，和加强餐饮和食品卫生的管理，及时发现带菌者，做好各种动物的管理工作，把能传播该菌的途径有效的控制好。试验过程建仪采用BSL-2级水平的操作技术、防扩散设备和设施。实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内。不得穿着外出，更不能携带回家。用过的工作服应先在实验室中消毒，然后统一洗涤或丢弃。当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套。如可能发生感染性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。操作台面用70%酒精或含氯消毒剂擦拭，废弃物处理按本实验室废弃物处理制度进行。第四章副溶血性弧菌的生物危害评估报告副溶血性弧菌（VibrioParahemolyticus,VP）是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即可杀死；对热的抵抗力也较弱。副溶血性弧菌食物中毒多发生在6~10月，海产品大量上市时。中毒食品主要是海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染。。1.PCR检测用于检测V．p的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarilyprimedPCR，Ap-PCR)、针对副溶血性弧菌任意引物PCR、多重PCR(muhiplex-PCR)、实时PCR(Real-timePCR)。实时PCR常规PCR检测，需要从反应体系中吸取产物做电泳或Southern杂交等试验进行鉴定，转移过程中易污染，造成假阳性，而且耗费时间。1996年，Tyagi开创了一种实时PCR(Real-timePCP,)。实时PCR是在，PCR反应体系中加入标记有报告基团和淬灭基团的线性Taqman。探针或茎环型荧光分子信标探针，在墓因扩增过程中，与产物杂交，此时，报告基团和淬灭基团分开，根据能量共振转移现象，报告基团发出荧光而被检测。这种方法操作简单，闭管检测，减少污染，灵敏度高，并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测，面且可以进行临床大规模快速检测。2.流行病学传染源传染源为病人，集体发病时往往仅少数病情严重者住院，而多数未住院者可能成为传染源，但由于病人仅在疾病初期排菌较多，其后排菌迅速减少，故不至因病人散布病菌而造成广泛流行。传播途径本病经食物传播，主要的食物是海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。地区分布特点：日本及我国沿海地区为副溶血性孤菌食物中毒发病率的高发区。据调查，我国沿海水域、海产品中副溶血性弧菌检出率较高，尤其是气温较高的夏秋季节。但近年来随着海产食品的市场流通，内地也有副溶血性弧菌食物中毒的散在发生。季节性特点及易感性：7～9月常是副溶血性弧菌食物中毒的高发季节。男女老幼均可患病，但以青壮年为多，病后免疫力不强，可重复感染。食物的种类：主要是海产品，其中以墨鱼、带鱼、虾、蟹最为多见，如墨鱼的带菌率达93%，其次为盐渍食品。食品中副溶血性弧菌的来源：人群带菌者对各种食品的直接污染。沿海地区饮食从业人员、健康人群及渔民副溶血性弧菌带菌率为11.7%左右，有肠道病史者带菌率可达31.6～88.8%。间接污染，沿海地区炊具的副溶血性弧菌带菌率为61.9%，被副溶血性弧菌污染的食物，在较高温度下存放，食用钱加热不彻底或者生吃，或熟制品受到带菌者、带菌的生食品、带菌容器及工具等的污染。3.治疗措施支持及对症治疗脱水者需输入生理盐水及葡萄盐水，或口服补液盐，以纠正失水。血压下降者，除被动补充血容量，纠正酸中毒等外，可酌用血管活性药。抗菌药物轻度患者可不用抗菌药物，较重者可给复方新诺明或庆大霉素、阿米卡星和诺氟沙星等喹诺酮类抗菌药物【上述抗生素类可能使细菌产生耐药性，使用须谨慎】。发生中毒后要立即停止食用可疑中毒食品，并到医院医治。副溶血性弧菌对氯霉素敏感。呕吐、腹泻严重者要补充水和盐。4.中毒预防加工海产品的案板上副溶血弧菌的检出率为87.9%。因此，对加工海产品的器具必须严格清洗、消毒。海产品一定要烧熟煮透，加工过程中生熟用具要分开。烹调和调制海产品拼盘时可加适量食醋。食品烧熟至食用的放置时间不要超过4个小时。主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏（肝、脾、肺）淤血等。第五章致泻大肠埃希菌的生物危害评估报告1.生物学特性大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，统称为致泻性大肠杆菌，一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。大肠埃希氏菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15大肠埃希氏菌生华物性是，发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇产酸产气，分解蔗糖因菌株而异，录素酶试验阴性，IMVi试验++--，有些菌株如碱性异型菌群，微产碱，不产气，无动力，易与志贺菌混淆。大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。现巳知有171个O抗原、99个K抗原和56个H抗原。2.危害程度分类根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。3.致病性和感染剂量致泻大肠埃希氏菌在人和动物的大便中大量存在，引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病，其中尤以EPEC、ETEC所占比例为大。其中有少数几种引起人类食物中毒，部分埃希氏菌株與嬰兒腹瀉有關，並可引起成人腹瀉或食物中毒的暴發，感染剂量约为107～108。尽管目前报道各地主要腹泻病是由志贺氏菌或轮状病毒引起的，但是，多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性。还有，致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%以上4.暴露的潜在后果摄入是主要的实验室危害，可引起实验人员感染。暴露在气溶胶中能否造成危害尚不清楚。5.感染途径通过污染食品和水源经口传播。6.微生物在环境中的稳定性此菌对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但是在30分钟内快速冷冻，将37℃降至4℃的过程，可杀死此菌。加热60℃7.浓度和浓缩标本的容量一般样本检测。8.自然和易感人群宿主致泻大肠埃希氏菌的宿主主要为牛、猪、羊、鸡等家禽家畜，许多被该微生物污染的食物都不得可以作为传播媒介，幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。9.实验操作活动致泻大肠埃希氏菌巳证明会对实验人员造成危害。摄入是主要的实验室危害，暴露在气溶胶中能否造成危害尚不清楚。按照国家标准方法对样本（粪便、食品、水样）进行分离，培养，鉴定。建议采用BSL-2级水平的操作技术，防扩散设备和设施。一旦发生意外，按照本实验室的《意外事故应对方案和应急程序》进行处理。10.预防和治疗致泻大肠埃希氏菌引起人体以腹泻症状为主疾病，根据菌型不同可引起如一些疾病：轻度水泻，痢疾样腹泻、出血性腹泻，也可引起食物中毒性疾病。目前尚无可用于人类的疫苗。对本病的治疗，病人应予胃肠道隔离，除一般治疗外，可根据大便细菌培养及药物敏感试验选用适当的抗菌药物作病原治疗，如选用庆大霉素、丁胺卡那霉素等。预防致泻大肠埃希氏菌的感染，首先是要做好个人卫生。切实做好饮食卫生、水源及粪便管理,消灭苍蝇,切断传播途径，防止病从口入。第六章伤寒沙门氏菌的生物危害评估报告伤寒沙门菌，又称伤寒杆菌，属沙门菌属D组。革兰染色阴性，呈短杆状，周有鞭毛，能活动，不产生芽孢，无荚膜。在普通培养基上能生长，在含有胆汁的培养基中生长更好。伤寒杆菌在自然界中的生活力较强，在水中可存活2—3周，在粪便中能维持1—2个月，在牛奶中不仅能生存，且可繁殖。耐低温，在冰冻环境中可存活数月，但对光、热、干燥及消毒剂的抵抗能力较弱，日光直射数小时即死，加热至60~C后30分钟或煮沸后立即死亡，消毒饮水余氯可迅速致死。伤寒杆菌只感染人类，在自然条件下不感染动物。伤寒杆菌具有菌体(“O”)抗原、鞭毛(“H”)抗原和表面(“i'’)抗原，均能产生相应的抗体，但这些并非保护性抗体。由于“O”和“H”抗原性较强，故常用于血清凝集试验(肥达反应)以辅助临床诊断，亦可用以制备伤寒菌苗供预防接种。“i'’抗原见于新分离(特别是从病人血液分离)的菌株，能干扰血清中的杀菌效能和吞噬功能，是伤寒杆菌的重要毒力因子，但其抗原性不强，所产生的“i'’抗体的凝集效价一般较低且为时甚短。当病原菌从人体中清除后，“i'’抗体滴度迅速下降，故“i'’抗体的检出虽对本病的诊断无多大帮助，但有助于发现带菌者。伤寒杆菌在菌体裂解时可释放强烈的内毒素，对本病的发生和发展起着较重要的作用。1.流行病学(一)传染源：为病人及带菌者。病人从潜伏期开始即可从粪便排菌，从病程第1周末开始经尿排菌，故整个病程中均有传染性，尤以病程的2—4周内传染性最大。慢性带菌者是本病不断传播或流行的主要传染源。原有慢性肝胆管疾病(如胆囊炎、胆石症等)的伤寒病人易成为慢性带菌者，约1％—4％患者在肠道和胆囊中隐藏伤寒杆菌达数月或数年之久。(二)传播途径伤寒杆菌随病人或带菌者的粪、尿排出后，通过污染的水或食物、日常生活接触、苍蝇和蟑螂等传播。其中，水源污染是本病传播的重要途径，亦是暴发流行的主要原因。食物污染也可引起本病的流行，而散发病例一般以日常生活接触传播为多。(三)人群易感性人对伤寒普遍易感。病后可获得持久性免疫，再次患病者极少。(四)流行特征世界各地均有本病发生，以热带、亚热带地区多见，可散发、地方性流行或暴发流行。在发展中国家主要因为水源污染而暴发流行，发达国家则以国际旅游感染为主。本病终年可见，但以夏秋季最多。其中以儿童和青壮年居多。局部地区流行的伤寒耐药菌株有所增加，耐药谱也在逐渐扩大。除耐氯霉素、复方磺胺甲嗯唑、氨苄西林外，少数菌株对头孢菌素及喹诺酮类抗菌药物也产生耐药性。2.实验室检查（一）常规检查：血白细胞大多为3×109/L～4×109/L，伴中性粒细胞减少和嗜酸粒细胞消失，后者随病情的好转逐渐回升。极期嗜酸粒细胞＞2%，绝对计数超过4×108/L者可基本除外伤寒。高热时可有轻度蛋白尿。粪便隐血试验阳性。（二）细菌学检查：①血培养是确诊的论据，病程早期即可阳性，第7～10病日阳性率可达90%，第三周降为30%～40%，第四周时常阴性；②骨髓培养阳性率较血培养高，尤适合于已用抗菌素药物治疗，血培养阴性者；③粪便培养，从潜伏期起便可获阳性，第3～4周可高达80%，病后6周阳性率迅速下降，3%患者排菌可超过一年；④尿培养：病程后期阳性率可达25%，但应避免粪便污染；⑤玫瑰疹的刮取物或活检切片也可获阳性培养。（三）免疫学检查1.肥达氏试验：伤寒血清凝集试验即肥达反应阳性者对伤寒，副伤寒有辅助诊断价值。检查中所用的抗原有伤寒杆菌菌体（O）抗原，鞭毛（H）抗原，副伤寒甲，乙，丙鞭毛抗原共5种，目的在于用凝集法测定病人血清中各种抗体的凝集效价。病程第1周阳性反应不多，一般从第2周开始阳性率逐渐增高，至第4周可达90%，病愈后阳性反应可持续数月之久。有少数病人抗体很迟才升高，甚至整个病程抗体效价很低（14.4%)或阴性（7.8%～10%），故不能据此而排除本病。Widal试验已沿用近100年，60年代曾有人对其特异性提出异议，认为其结果存在着混乱模糊的情况，非伤寒发热性疾病Widal's试验也呈阳性结果，如各种急性感染，肿瘤，结缔组织病性疾病，慢性溃疡性结肠炎，均可出现阳性结果。Perlnan等认为无菌的结肠细胞和肠杆菌可能有共同的抗原，结肠粘膜损害所产生的抗结肠抗体与沙门菌菌体抗原起交叉反应，因此对肥达氏反应结果的判定宜审慎，必须密切结合临床资料，还应强调恢复期血清抗体效价的对比，有人提出应用流行菌株抗原与国际菌株相比，阳性率可提高，建议用当地流行菌株取代国际标准菌株，以提高流行区域伤寒诊断的阳率。2.其他免疫学检查（1）被动血凝试验（PHA）：用伤寒杆菌菌体抗原致敏红细胞，使之与被检血清反应，根据红细胞凝集状况判断有无伤寒特异性抗体存在，国内外报道阳性率90%～98.35%，假阳性率5%左右。鲍行豪等曾报道LSP-PHA对伤寒血培养患者的检出率为89.66%，早期病人90.02%，临床确诊者为82.5%，且主要检测的是特异IgM抗体，故可用于早期诊断。（2）对流免疫电泳（CIE）：本方法可用于血清中可溶性伤寒抗原或抗体的检测，操作简便，便于基层推广，特异性较高；但敏感性较低，不同作者报道为24%～92%，主要受采集血清时间的影响，发病初期最易测出，故可用于伤寒的早期诊断。（3）协同凝集试验（COA）：利用金葡菌的葡萄球菌A蛋白（SPA）可（2）对流免疫电泳（CIE）：本方法可用于血清中可溶性伤寒抗原或抗体的检测，操作简便，便于基层推广，特异性较高；但敏感性较低，不同作者报道为24%～92%，主要受采集血清时间的影响，发病初期最易测出，故可用于伤寒的早期诊断。（4）免疫荧光试验（IFT）：Doshi等用伤寒杆菌菌体Vi悬液作抗原进行间接免疫荧光抗体检测，140例血培养阳性的伤寒患者134例（95.7%）阳性；394例对照者仅4例（1%）假阳性，目前有关本法的报道尚少，伤寒疫预防接种和其它沙门氏菌感染是否会影响本试验特异性，尚需进一步研究。（5）酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA的基本原理是用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，既可检测抗原，又可检测抗体，用ELISA法检测伤寒患者Vi抗原，灵敏性达1ng/ml，高于CoA法9100ng/ml，并可检测到1∶1024稀释后尿液中的Vi抗原。国内、外用ELISA检测过临床标本中的Vi抗原，V9抗原，LPS，H抗原等，敏感性在62.5%～93.1%，因检测抗原的不同而异，多数在80%以上。杭州鲍行豪等应用ELISA同时检测IgM和IgG抗体，LPS-IgM-ELISA的敏感性为91.38%，特异性为99.02%，LPS-IgG-ELISA分别为93.1%和98.02%，在伤寒的血清免疫学诊断方法中，ELISA方法简便，快速，敏感，特异性高，是公认较好的一种诊断方法。（四）分子生物学诊断方法1.DNA探针（DNAProbe）DNA探针是用DNA制备的诊断试剂，用于检测或鉴定特定的细菌，方法是用一段已标记的特定的DNA片段（探针）与标本中已变性的细菌DNA杂交，通过测定是否发生杂交反应来达到检测目的，由于此探针是以细菌专有的特异性基因片断制备，故特异性很高。用DNA探针对培养所得的伤寒杆菌进行检测，敏感性需标本中达1000个细菌才能检出。DNAProbe的特异性高而敏感性低，一般用于菌种鉴定及分离。2.聚合酶链反应（PCR）PCR方法是80年代中后期发展起来的一种分子生物学方法，它能在数小时内在体外将目标基因或DNA片段扩增到数百万倍，检出率较DNA探针高100～10000倍，国外JaeHS等用PCR方法扩增伤寒的鞭毛抗原编码基因，敏感度能检出10个伤寒菌，特异性为100%，PCR方法因其高度敏感，易出现产物污染，所以控制PCR方法的假阳性及假阴性，是提高准确度的关键。3.细菌的生物安全防护在实验室操作上对于有高风险的人员，如免疫缺陷者，要严格限制进入。对于针头和锐器要有警示，要用专门存放锐器的容器盛装。在个人防护上，要求穿隔离衣，出实验室时应将隔离衣脱下；在可能接触病原时要戴一次性使用的手套，但不要戴手套接触清洁表面（如电话等），脱去手套后要洗手；在BSC外面进行操作时，要进行面部保护，如套口罩、眼罩、面罩等。要有泡手消毒缸和洗眼台，还要有高压消毒器第七章志贺氏菌的生物危害评估报告1.生物学特性志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。志贺氏菌和大肠杆菌都属于肠杆菌科，根据DNA杂交研究结果表明，志贺氏菌属的四个种和大肠杆菌属在生化上是难以区分的，因为有产气的志贺氏菌，也有乳糖阴性、不产气、不运动的大肠杆菌，有些大肠杆菌也能引起痢疾状的腹泻。志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μm,宽0.5-0.7μm。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。志贺氏菌需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、39个血清型。2.危害程度分类根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该菌危害程度为第三类。3.致病性和感染剂量志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄，只需少量病菌（至少为10～100个细胞）进入，就有可能致病。致病因素：志贺氏菌的致病作用，主要是侵袭力、菌体内毒素个别菌株能产生外毒素。志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类一类是急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型；二类是慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型三型。病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。4.暴露的潜在后果暴露后可能引起感染，菌量大时可使实验人员显性感染，菌量很少时常呈暂时的带菌状态。被感不染后，成为传染源，可能对周围及环境造成污染，应及时得到控制。5.感染途径通过污染食品和水源经口传播，无其它感染途径。6.微生物在环境中的稳定性志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天，37℃水中存活20天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-60℃10分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。7.浓度和浓缩标本的容量一般样本检测。8.自然和易感人群宿主人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。9.实验操作活动巳有文献证明，志贺氏菌可造成实验人员感染细菌性痢疾，仅在美国和英国就有数十例报告。尽管在捕获的非灵长类动物中曾有过暴发，但人类是惟一重要的传染源。然而，实验室感染的豚鼠、其他啮齿类动物和非人灵长类动物也是被证实的传染源。这种病原体可以存在于受感染的人或动物的粪便中，极少存在于血液中。摄入及胃肠道外接种该病原体是主要的实验危害。人类经口感染福氏志贺菌的ID25～50大约是200个细菌。暴露在气溶胶中能否引起感染目前还不清楚。按照国家标准方法对样本（粪便、食品、水样）进行分离，培养，鉴定。建议采用BSL-2级水平的操作技术，防扩散设备和设施。一旦发生意外，按照本实验室的《意外事故应对方案和应急程序》进行处理。10.预防和治疗志贺氏蓖可引起细菌性痢疾。细菌性痢疾又可分为两类，一类是急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型；二类是慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型三型。目前疫苗还不可用于人类。对本病的治疗，病人应予胃肠道隔离，除一般治疗外，可根据大便细菌培养及药物敏感试验选用适当的抗菌药物作病原治疗。如复方磺胺甲基异唑、氯霉素、庆大霉素及卡那霉素等。亦可应用氨苄青霉素或氧哌嗪青霉素等治疗。中毒性痢疾应予相应的抢救措施，如抗休克、冬眠药物和脱水药的应用等。慢性菌痢可采用保留灌肠的方法治疗。。预防沙门氏菌感染，首先是要消灭传染源是预防措施之一，除治愈患者外，必须对托幼、饮食业及自来水厂工作人员定期检查，及时发现带菌者，调离工作岗位并予以治疗。切实做好饮食卫生、水源及粪便管理,消灭苍蝇,切断传播途径，防止病从口入。第八章蜡样芽胞杆菌的生物危害评估报告1.细菌的传播与致病蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国则主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。严重者还可导致败血症。蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌可产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0×103。致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。2.细菌的生物学特性蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，需氧或兼性需氧，生长6h即可形成原形芽胞，芽胞位于菌体的中心或次末端不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力无荚膜。它的生长温度为25-37℃，最佳温度30-35℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状故而得名。偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。在甘露醇、卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素等，VP实验阳性，可液化明胶，卵磷脂酶阳性，但多次传代后，其生化特性常可改变。此外蜡杆芽胞杆菌耐热，其食物中毒菌株中的游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需120℃60分钟才能杀死。本菌对氯霉素、红霉素和庆大霉素敏感，对青霉素、磺胺类和呋喃类耐药。3.细菌的实验室检查及其它检查1.标本收集采集可疑食物或收集粪便和呕吐物进行直接涂片染色镜检和其他操作。2.活菌计数无菌操作称取样品50g放入灭菌搅拌缸内。加Butterfield磷酸盐缓冲稀释液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均质2min。用上述1:10稀释液，连续稀释供蜡样芽胞杆菌计数。移取10mL均质样液（1:10稀释）加到90mL空白液中，从10-2到10-6制备一系列稀释液，充分混匀，并继续稀释直到10-6为止。取样品的各个稀释液（包括1:10）0.1mL接种2只MYP（甘露醇一卵黄多粘菌素琼脂）平板，用灭菌玻璃棒在每只平板表面涂布均匀。将平板置30℃3.MPN技术被推荐用于食品中低于10个/g蜡样芽胞杆菌的检验。某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。在胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中接种3管MPN系列，10-1、10-2、10-3的稀释液各接种1mL于3管。将培养管置30℃培养48±2小时，检查生长密集、典型的蜡样芽胞杆菌。将阳性管培养物划线接种于MYP平板，于304.分离培养将可疑食物置无菌乳钵中，加适量生理盐水研磨后，划线接种于普通琼脂平板或血琼脂平板，若为呕吐物可直接划线接种于上述平板，于37℃培养5.若有类似蜡样芽胞杆菌的菌落出现再进一步分离纯化以及进行生化反应。6.蜡样芽胞杆菌的证实试验蜡样芽胞杆菌的分离物应符合下述条件：1)革兰氏阳性产芽胞大杆菌，其芽胞不突出体外；2）在MYP琼脂上产生卵磷脂酶而不发酵甘露醇；3）厌氧培养生长，发酵葡萄糖产酸；4）还原硝酸盐；5）VP阳性；6）分介L-酪氨酸；7）在含0.001%溶菌酶的培养基中能生长。7.蜡样芽胞杆菌群的鉴别试验要鉴别典型蜡样芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌群的其它种还需进一步进行下述试验：1）动力试验；2）根状生长试验；3）溶菌活性试验；4）蛋白质毒素结晶试验：蜡样芽胞杆菌有动力、强溶血、不形成根状菌落，或不产生蛋白质毒素结晶。而且蜡样芽胞杆菌在4℃8.血清学分型、噬菌体分型。4.细菌的防治蜡样芽胞杆菌所引起的食物中毒多因食品在食用前保存温度较高（20℃以上）和放置时间较长，故对中毒的预防包括：由于蜡样芽胞杆菌在15℃以下不繁殖，剩饭、剩菜应放在低温保存。该菌污染的食品一般无腐败变质的异味，不易被发觉。因此，剩饭、剩菜在食用前一定要再加热。注意食品的贮藏和个人卫生，防止尘土、昆虫及其他不洁物污染食品。若一旦发生了中毒，则立即停止食用可疑污染的食品，多饮水。一般不需要使用抗生素治疗。腹泻较重者可到医院就诊。5.细菌的生物安全防护根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，人间传播的微生物名录（待颁布）蜡样芽胞杆菌属于三类，BSL-2。（1）操作要求1、实验时，未经实验室主任同意，限制或禁止进入实验室。2、不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。3、所有的操作过程应尽量细心，避免产生和溅出气溶胶。4、对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器等。5、注射和吸取感染材料时，只能使用针头固定注射器或一次性注射器（即注射器和针头是一体的）。用过的一次性针头必须弯曲、切断、破碎、重新套上针头套、从一次性注射器上去掉，或在丢弃前进行人工处理，要不将之小心放入不会被刺穿的、用于收集废弃锐器的容器中。非一次性锐器必须放置在坚壁容器中，转移至处理区消毒，最好高压杀菌。6、打碎的器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前，应按照相关的规定进行消毒。7、所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。离开该系统进行消毒的物料，在转移前应包装，其包装应符合有关的法规。8、溅出或偶然事件中，明显暴露于传染源时，要立即向实验室主任报告。进行适当的医学评估、观察、治疗，保留书面记录。9、按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后，实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。污染的设备在送去修理、维护前，要按照相关的规定消毒；在离开设施转移前，要按照相关的规定打包运输。（2）安全设备1、正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。2、确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程，包括离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超声波破裂、开启装有传染源的容器、采集感染标本等。3、涉及高浓度或大体积的传染源时，若选用密封转头或带安全罩的离心机，若转头或安全罩仅在生物安全柜中打开，则可在开放实验室内离心。4、当必须在生物安全柜外处理标本时，需采取面部保护措施（跟镜、口罩、面罩、或其他防溅装置），以免传染源或其他有害物溅或洒到面上。5、在实验室内，必须使用专用的防护性外衣、大褂、罩衫或制服。人员到非实验室区域时，防护服必须留在实验室内。防护服可以在实验室内处理，也可以在洗衣房中洗涤，但不能带回家中。6、可能接触潜在传染源、被污染的表面或设备时，要戴手套。一次性手套不用清洗、不能重复使用，不能用于接触“洁净”的表面（键盘、电话等），也不应当戴着到实验室外。要备有带滑石粉的乳胶手套。脱掉手套后，要洗手。第九章单核增生李斯特菌的危害评估报告1.细菌的传播与致病产单核李斯特菌是李斯特菌属中唯一可对人类致病的菌种，能够引起李斯特菌病，主要表现为脑膜炎和败血症。健康的带菌者是主要的传染源，可以经粪-口途径传播，也可以通过胎盘和产道由带菌的母亲感染给新生儿。如果人的眼睛或皮肤与带菌的病畜直接接触，也可造成局部感染。产单核李斯特还能引起鱼类、鸟类和哺乳动物牛、羊等多种动物疾病。2.细菌的生物学特性产单核李斯特菌是一种革兰阳性短小杆菌，大小约为1~2μm×0.4~0.5μm，通常成双排列，偶尔可见双球状。有鞭毛，但仅在18~20℃有动力，在37℃动力缓慢。无芽胞，一般不形成荚膜，但在含有血清的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。兼性厌氧，对营养要求不高，普通培养基上可生长，在血平板上会形成β-溶血。最适的生长温度是30~37℃，并可在4℃条件下进行冷增菌。产单核李斯特菌与葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌等及大肠埃希菌具有共同抗原。根据菌体及鞭毛抗原的不同，可将其分为4个血清型，1、3、4型还可分为若干亚型。抗原的结构与毒力无关，致病的物质主要是溶血素和菌体表面成分。其中1型主要感染啮齿动物，4型主要感染反刍动物。但各型均可对人类致病，尤以1a和1b最为多见。本菌耐碱不耐酸，对热较为敏感，加热50℃10min即可死亡。同时该菌对多种抗生素敏感，以氨苄青霉素为首选，尚有青霉素、链霉素、四环素、氯霉素和红霉素等敏感。但该菌对磺胺、杆菌肽和多粘菌素耐药。3.细菌的实验室检查1、标本采集采集来自临床的各种标本，如脑脊液和血液。此外还可根据症状采集子宫、子宫颈、阴道、鼻咽部等部位的分泌物或组织，还有新生儿脐带残端、羊水及胎粪、尿等送检。2、涂片镜检除了血液标本外，其余标本都可以涂片做革兰染色镜检，或用产单核李斯特菌1型和4型及多价荧光抗体进行染色。3、动力检查在18~20℃有动力，在374、分离培养取脑脊液离心后的沉淀物划线接种于羊血琼脂平板上，于10%CO2环境中进行培养，35℃孵育18~24h；血液标本5ml注入含有50ml培养基的血培养瓶中，同样在含10%CO2环境中进行培养；咽喉拭子、组织及粪便标本可接种于肉汤培养基置4℃冰箱中进行冷增菌。结果：产单核李斯特菌在血琼脂平板上能产生狭窄的β-溶血环，菌落呈灰白色，直径1~5、生化鉴定本菌可发酵多种糖类如葡萄糖、果糖、覃糖、麦芽糖核水杨素，产酸不产气。甲基红和V-P实验阳性，触酶阳性，可使石蕊牛乳缓慢产酸并使其脱色，能水解精氨酸产氨。不还原硝酸盐、不形成吲哚、不液化明胶和凝固血清，不分解尿素。能水解七叶苷，有时还可形成硫化氢。6、血清学实验用已知的李斯特菌1型、4型和多价抗血清玻片凝集试验对可疑菌进行鉴定。7、动物结膜点种试验取幼兔或豚鼠一只，用本菌24h肉汤培养物1滴，滴入实验。8、动物一侧的结膜囊内，以另一侧为对照，观察5天。一般产单核李斯特菌会在接种后的24~36h内，出现化脓性结膜炎。4.细菌的生物安全防护根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，人间传播的微生物名录（待颁布）产单核李斯特菌属于三类，BSL-2。相关的防护事宜包括：（1）操作要求1、实验时，未经实验室主任同意，限制或禁止进入实验室。2、不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。3、对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器等。4、注射和吸取感染材料时，只能使用针头固定注射器或一次性注射器（即注射器和针头是一体的）。用过的一次性针头必须弯曲、切断、破碎、重新套上针头套、从一次性注射器上去掉，或在丢弃前进行人工处理，要不将之小心放入不会被刺穿的、用于收集废弃锐器的容器中。非一次性锐器必须放置在坚壁容器中，转移至处理区消毒，最好高压杀菌。5、打碎的器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前，应按照相关的规定进行消毒。6、所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。离开该系统进行消毒的物料，在转移前应包装，其包装应符合有关的法规。7、按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后，实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。污染的设备在送去修理、维护前，要按照相关的规定消毒；在离开设施转移前，要按照相关的规定打包运输。（2）安全设备1、正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。2、确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程，包括离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超声波破裂、开启装有传染源的容器、采集感染标本等。3、涉及高浓度或大体积的传染源时，若选用密封转头或带安全罩的离心机，若转头或安全罩仅在生物安全柜中打开，则可在开放实验室内离心。4、在实验室内，必须使用专用的防护性外衣、大褂、罩衫或制服。人员到非实验室区域时，防护服必须留在实验室内。防护服可以在实验室内处理，也可以在洗衣房中洗涤，但不能带回家中。5、可能接触潜在传染源、被污染的表面或设备时，要戴手套。一次性手套不用清洗、不能重复使用，不能用于接触“洁净”的表面（键盘、电话等），也不应当戴着到实验室外。要备有带滑石粉的乳胶手套。脱掉手套后，要洗手。第十章流感病毒的危害评估报告流感病毒属正粘病毒科，分甲、乙、丙三型。具有“变异”特性，不断产生新的亚型。可引起人或家禽的流行性感冒。这是一种急性呼吸道传染病，它具有突然暴发、迅速蔓延、波及面广的特点。在人群中，它的发病率高，病死率低，多发于青少年，恢复快，具有一定季节性。而禽流感发病率和病死率高，季节性不强，来源常不明。20世纪曾有4次流感大流行。流感流行时造成的经济损失名列各传染病之首。流感是第一个实行全球监测的传染病。病人和病禽是主要的传染源。传播途径以空气飞沫传播为主，也存在通过水源、密切接触、垂直传播、蚊虫传播等多种途径。人群普遍易感，病后免疫时间短，而流感病毒变异性大，但型间无交叉免疫，所以人在一生中可多次患流感。流感病毒在外界的抵抗力弱，在56℃30分钟条件下易被灭活，在室温下传染性很快丧失，100℃1分钟即被灭活，但在0～4℃能存活数周，在-20℃真空干燥条件下可长期保存。对紫外线和化学有毒剂敏感。病毒暴露于通常使用的各种消毒剂和固定剂后，病毒即失去感染性。流感极易传播，因此发现有流感病人，应及早隔离和治疗。流感流行期间尽可能避免人群集聚，注意房屋通风，提倡在公共场所戴口罩，病人的口鼻腔分泌物及污染物应随时消毒。疫苗接种对预防流感有一定效果。保持环境卫生，养成良好的卫生习惯也能起预防作用。流感是一自限性疾病，可使用抗流感病毒药物和对症治疗来减轻症状。用抗菌素防止细菌继发感染产生的并发症。1.实验模式1.1流感病毒的分离培养流感病毒大量存在于病人痰液、咽拭子和病禽尸解脏器中。分离流感病毒时，可用鸡胚，最好用SPF鸡胚，但一般只采用尿囊腔接种；也可用狗肾细胞（MDCK）。1.2流感病毒血清学诊断血凝抑制试验（HI法）或微量中和法。必须采集双份血清，疾病发作时头3天立即采集（急性期血清），发病后2-3周采集（恢复期血清），在同一条件下进行HI测定，在恢复期血清HI抗体滴度比急性期的高4倍或以上，就可加以确诊。1.3流感病毒抗体检测可用免疫荧光法和ELISA。1.4流感病毒核酸检测逆转录PCR2.实验中危害因素分析流感传播途径以空气飞沫传播为主，也存在通过水源、密切接触、垂直传播、蚊虫传播等多种途径。操作具有高致病性的甲性H5和H7两亚型毒株必须在P3实验室内进行操作。特别是一些甲性流感毒株（H5N1，H9N2）通过何种途径传染人至今不清楚，因此采集标本时，须做好一定的个人防护。流感病毒易发生基因重配，易形成新的亚型，但型间无交叉免疫。3.安全措施3.1严格按实验室使用和安全操作技术规程及各个实验项目的操作技术规程操作。3.2加强个人防护。采用符合国家标准的口罩、防护服等个人防护用品，3.3强化离心、移液等环节的标准操作。3.4抗体检测用血清标本可先以56℃30分钟处理。第十一章禽流感病毒的危害评估报告禽流感病毒（AIV）属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些亚型也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类；乙型和丙型流感病毒则分别见