信号转导方法

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何时何地表达

基因过表达，或基因沉默(细胞水平和整体水平)

相互作用蛋白

立体论证

基因水平转录水平

转录后加工翻译水平翻译后加工

mRNA和蛋白质降解蛋白质基因表达可以在不同层次上调节基因表达分析方法启动子分析:---EMSA---Reportergeneassay---CHIPassay---NuclearRun-onassay---DNAFoot-printingassay---DNAtruncationand site-directedmutagenesis翻译水平分析:---WesternBlots---Immunocytochemistry Immunohistochemistry---Proteinmodification---Proteomics转录水平分析: ---RT-PCR ---RealTimePCR ---In

situhybridization ---Northernblots ---RNaseprotectionassay---Primerextentionassay比较转录组学:---Differentialscreening---Subtractivehybridization---Differentialdisplay---Array-basedmethods1.蛋白质表达水平和细胞内定位研究信号蛋白分子表达水平检测:Westernblotanalysis.

ELISAProteomics

信号蛋白分子在细胞内定位研究:

Immunohistochemistry/Immunocytochemistry

Immunofluorescence(IF)Greenfluorescentprotein(GFP)-fusionprotein—typically,livecells.印迹技术blotting将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上，并加以检测分析的技术。应用：DNA、RNA、蛋白质的检测

DNA印迹:SouthernblottingRNA印迹:Northernblotting蛋白质印迹:Westernblotting又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术。蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移（电转）至膜性支持物上(NC膜）,再与溶液中的抗体相互结合的技术。主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析、蛋白质化学修饰（磷酸化），以及蛋白质分子间的相互作用研究等。WesternblottingElectrophoresis转膜Protein

HRPDABH2O21Ab2Ab抽提细胞蛋白，定量聚丙烯酰胺凝胶电泳与特异性抗体杂交。根据标记物特点显色硝酸纤维素膜目的蛋白质抗目的蛋白一抗标记的二抗偶联的碱性磷酸酶磷酸化生色体系脱磷酸显色采用Westernblot方法检测蛋白质原理示意图应用举例某药物是否可引起目的蛋白的表达变化（上调或下调）？

分别抽提细胞蛋白（未处理、药物处理），定量相同质量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹（电转移）杂交（抗体）显色/显影根据显影结果判断：内参目标蛋白检测标本很多的情况下Western

无法满足高通量的需求ELISA/Phosphospecific-ELISAs(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)检测蛋白质表达量或者活性状态(化学修饰-磷酸化)比westernblot更快速、更高效.蛋白质组（proteome）：一个基因组所表达的全部蛋白质.蛋白质组学（proteomics)：研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。

蛋白质组学(Proteomics)同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同；在空间和时间上呈动态变化蛋白不质组旱学研葬究技杰术平装台(高效厦率,高通射量)双向烟电泳踢分离竞样品晴蛋白覆质蛋白破质点每的定崭位和霞切取质谱轰分析第一露向：等电详聚焦熔电泳（IE咳F）第二惧向：SD获S-蚂PA蔬GE电泳免疫扁荧光驰技术Im水mu绒no醒fl何uo描re糠sc俱en尚ce她(社IF立)利用置某些芒荧光偏素如FI剂TC等通凝过化膛学反炕应与苏抗体楚或其五它蛋接白结怎合制酷备成附荧光隐探针序，然性后与北被测旬抗原修或配常体发送生特抓异性馋结合碗，形茅成的骆荧光行复合侄物在窗一定咬波长监光的习激发袄下可烂产生第荧光摸，因霞此利摧用荧久光显禽微镜递可对身抗原梳进行炼定性门或定禽位检蛇测。采用荐流式腐细胞袜免疫吩荧光驾技术狱（FC切M）可嫌从单岛细胞煎水平贺检测生不同作细胞马亚群知中的墓蛋白环质分予子，榨用两辈种不某同的结荧光词素分纵别标悉记抗梅不同黑蛋白把质分咳子的争抗体协，可忆在同锁一细恋胞内坏同时该检测衔两种讨不同众的分梅子（Do幅ub追le勇I令F），也蔑可用户多参强数流万式细嫩胞术饶对胞滚内多陶种分仁子进柏行检灯测。2.蛋白湾质与景蛋白绒质相反互作论用研膜究技妥术:Co畜-I跨P（免疫裤共沉可淀）wi愚th占a求nt呼ib壳od月y油ag翻ai绕ns看t溜on蔬e驱pr碧ot浑ei埋n搅fo岁ll增ow舞ed忧b搏y稍We孟st组er潮n发bl也ot场w性it悲h艺an渴ti赤bo貌dy捐a悼ga硬in魂st喝a在no编th独er闭p哪ro草te织inGS朴T固pu床ll予-d评ow仿n赠as预sa饿yYe相as辨t吊tw板o-羞hy阶br睁id景a根ss龄ayFR虹ET朱(岭fl尸uo记re疯sc桶en钥ce洗r陈es迹on纵an读ce枪e共ne像rg巾y帝tr砍an慌sf雕er锈)as附sa竿yag梁ar事os苍ebe薯adIP是利起用抗宾原蛋细白质亏和抗晨体的育特异英性结半合以眯及细企菌蛋挖白质崇的“pr付ot腹ei产n恒A/师G”能特着异结率合免烫疫球男蛋白FC片段递的现借象而状发展希的方多法。装目前逢多用畏精制捧的pr协ot尝ei抬n讨A/翁G预先珠结合阔固化秘在ag钥ar村os水ebe机ad景s上，绣使之迫与含外有抗婚原的符溶液寇及抗胜体反良应后臣，be炉ad科s上的pr舱or圣ei京n沈A/娃G就能无吸附且抗原童抗体赶达到堪沉淀菠抗原余的目欺的。pr期ot卫ei歌n矮A抗原抗体YABY裂解艳细胞免疫明沉淀料蛋白妙质X免疫忙共沉础淀（Co弱-I朗P）技诱术非变责性条歼件下替裂解洗时，利完整酬细胞袖内存林在的泛许多间蛋白份质－凯蛋白活质间侵的相鸟互作浅用被胁保留遵了下膛来。港若用脂蛋白井质X的抗贵体免启疫沉掩淀X，那浑么与X在体轰内结丙合的仇蛋白际质Y也能蚁沉淀塘下来它。进锯一步福进行We示st贪er惜n碧Bl拐ot和质绞谱分盟析。骂常用文于测觉定两卫种目由标蛋厘白质后是否疼在体扩内结计合，均也可际用于刊确定医一种初特定抓蛋白宪质的局新的趁作用睬搭档接。缺点基：可宇能检龙测不白到低苦亲和牙力和房诚瞬间哲的蛋匆白质这相互剂作用脖。We去st长er隆n酸Bl你ot和质你谱分迹析Co朴-I挪P工作抵示意描图Co缺-i管mm普un况op删re罪ci疾pi霞ta孔ti毒onbi带nd前in旗gwa超shel怜ut勺io秋nYYYYYGS拨T融合陶蛋白振进行Pu逗ll克do篮wn实验GS具T桨pu郊ll速-d响ow松n蝇as季sa刮y原理将GS箱T融合片蛋白(ta耀gg残ed轨p队ro络te收in网(标记津蛋白)杀or物t启he纹b丑ai师t唤(饵蛋涉白)，GS布T,鹿H孔is而6,牧F醉la忆g,佳b景io底ti耕n储…)作为赖探针惜，与概溶液塌中的沙特异伶性搭袄档蛋争白(te草st撒p贪ro光te化in齐,叙or乐p杀re捏y被扑子获蛋遥白)结合灿，然欢后根象据谷贝胱甘译肽琼蜻脂糖予球珠夏能够其沉淀GS领T融合弦蛋白摊的能湿力来州确定汪相互眯作用喂的蛋坐白。赛一般狡在发泡现抗陕体干绞扰蛋治白质认－蛋页白质择之间金的相船互作悲用时宵，可腥以启富用GS沸T沉降拨技术沉。该传方法遗只是彼用于拒确定爬体外毕的相纳互作础用。GS贯T-冻Pu贱ll持do课wnAs欢sa吧y转录浸激活熄因子DN奔A结合禾结构疫域(B碎D)转录庭激活毫结构跟域(A受D)酵母都双杂查交技仿术酵母越双杂洗交技偿术是听一种怒基于苗转录警重建赢而建施立的约研究经生物好大分希子相买互作沿用的楚简便宁而有素效的都研究件方法录。在酵辈母细登胞中导分析坊蛋白渔质相支互作固用。以真耽核细醋胞转命录激简活因奖子的昼结构润为基晌础。将编除码某倡一蛋白X的DN狡A序列暮与DN妇A结合议域BD的编泊码序各列融脚合形申成一喂个杂椒交体(“诱饵”ba访it衔)，将成编码肌另一蛋白Y的DN呢A序列吼与DN院A激活暮域AD的编添码序誓列融辈合形天成另袋一个饭杂交杰体(“猎物”或靶论蛋白pr束ey饰o诸r愿ta位rg厅et检p锅ro涉te慕in临);当两晚个杂天交体撤共转币化酵怨母细僻胞（盲此酵皮母细宝胞含舟有上痕游有DN们A结合续位点毫的报泛告基闹因）摊，若X和Y没有状相互苦作用搜，则挽单独慕不能角激活吉报告肥基因篇的转蜜录；若X和Y可相棍互作切用，陷则使BD和AD靠近爷形成云一个崭有效灿的转撑录激罩活子榴，激禁活报菜告基夫因的汁转录苹。因此犁可通特过检煌测报献告基令因的胃转录谦来研范究蛋短白质X和Y的相访互作免用。乎但限据于核努内表摩达的竞蛋白炒质的险相互虫作用雨。酵母参双杂守交系薄统荧光购共振抢能量速转移(F荷RE靠T)是对生她物大隆分子肢之间律相互萝作用街定性撒、定你量检哭测的授一种扯有效寒方法助，是在活让体细档胞中接实时封地对生侵物大厉分子两之间稳的相宰互作腐用进者行动谦态监振测.两个迎携带讲不同仰荧光暂基团闯（如GF荷P、YF责P、CF抬P等）的大为分子柜在相蒙互间堂距离轿足够任近时晌会发劈燕生激穷发态独能量扭非放股射性汉地由著一个乘荧光车基团肚（供体具）向另贼一个即荧光归基团授（受体舰）转移摘的现继象。如果近发生FR敞ET，则茶供体气信号映将淬尿灭而掘受体辰信号脆将激缠活或砖增强.FR括ET检测虽系统恋可以味快速告高效亏地捕梨获来衡自标毒定分慰子间蓬相互体作用做的短声暂微伟弱的收荧光百信号南，而票以分酸子尺生度分姐辨出禁供体-受体跌的平借均距寨离，舅并能押显示紧出受钥体-供体忘的相芝互作慢用。蛋白在质直片接相从互作康用的港荧光浆共振基能量稳转移Flu倡or象es鸟ce傍nc抬eRes杨on只an啄ceEne否rg征yTra求ns抬fe汽r以光脆线激矮发后抖，供喝体荧岩光基晶团(E久CF勒P–捆X)会将括激发粱能量抚转移夹至距响离10喇–1择00虹Å以内勿的受茄体荧适光基算团(E碍GF刑P–尸Y)，使摩之发箭出荧牺光。所通过罪检测汁受体做荧光志基团鞠激发狱的荧伸光即助可确动认两叹蛋白似质间竹的相潮互作甜用。EC笑FP：强浪化型疑蓝荧懒光蛋旱白；EG栋FP：强裳化型馆绿荧奇光蛋东白FR咬ET3.磷酸昼化蛋户白质驼研究灾方法:We雪st嚼er更n示bl凭ot集w止it筑h芹ph共os守ph糊o-疮sp萄ec剧if奋ic役a鉴nt酒ib翠od忘ie啦s.EL姑IS草APh航os炮ph抄op遇ep漆ti符de抄a子nd趣p调ho螺sp区ho走am划in之o甩ac根idan辜al哭ys香is邀b校y误ma脉ss仔s左pe停ct通ro扰ph廊ot芹om驴et送ri哪c按an零al尤ys艘is易.激酶剂活性售的测锹定信号骑转导左过程既中往卡往涉矛及多凶种激慨酶的独活化暮，因波而对谦这些酱激酶侦活性条的测隆定在财信号意转导犯研究摸中具乳有重逮要意隆义。缓常见弟激酶欺活性喜的测登定有PT欧K、PK相C及PI学-3鞭K等。贞均有篇商品纪化的芬试剂浴盒。4.基因铺转录尘活性须检测信号辰蛋白匙转录镜水平酱表达够（mR云NA）的绑检测:RT赛-造PC特R/但Re模al活ti质me交R爬T-劳P团CRNo钓rt熔he摊rn树b盖lo凯t望an树al田ys随is绍.“g顺en眼e恶ch添ip盟”它to说m嫌ea姜su舱re唉c风ha淋ng艺es凯i崭n妹ge哀neex者pr煎es姐si粘on拨a仰t登la剩rg威er庭s忠ca陈le播s.基因秧启动阁子/增强旷子转籍录活辰性的语检测:Tr禁an荷si骂en狭t皇or啄s名ta搅bl拥e盗re撞po茶rt宾er驳a持ss摆ay效—l乔uc闷if征er巨as肉e旅(L岂uc至)采.RT便-侍PC赖RMarker组1组2内参基因目的基因RT：以po蚕ly斩T为引浊物，肚在逆芹转录烧酶催化扁下cD板NA合成PC督R：特异酿引物龄进行环目的DN希A的扩蜂增应用黎：1.获得屡目的表基因私（编光码蛋悉白）2.比较决不同团条件篮下mR破NA变化RT乐-刺PC卖RRe摇al控-t妥im锹e擦PC纤R用于衡基因DN奴A拷贝宅数和mR心NA表达荣定量澡分析荧光骨染料裕：每形棒成一需个DN晋A双链现，就掏有一搁定数肥量的言染料登结合扯上去竞，染矩料一锣结合洲就产递生荧编光信它号，漠信号平强度班与DN敲A分子丸总数姨目成域正比。①②Ta递qM惯an探针寡核哈苷酸齐探针员的5′端标致记一想个荧努光报体告基置团（re纸po幼rt晶er），3′端标储记一富个荧道光淬筛灭基享团（qu革en稻ch熟er）。报告言荧光艘基团赠与淬亿灭基团分离绑，荧化光共焦振能灵量转吵移不席再发佩生，钟报告屡基团充发绿青色荧福光当激孩发光评照射巡寿到探屑针时衡，被第激发画的报恋告基亮团将错能量墨转移涌给附哪近的著淬灭虹基团违而不权发光解。每产供生一谊条DN洒A链，拦就切宝断一援条探杨针，生每切向断一哲条探箭针，菜就产隐生一蕉个单饺位信抗号，匪信尖号强疯度与情结合惭探针诞的DN宇A分子道数成什正比。5.蛋白找质与DN带A相互汗作用译的研感究技琴术:Ge站l午sh允if争t枪(o叨r驼el进ec粮tr对op咽ho禽re植ti县c舍mo览bi吨li亦ty朽s灶hi虹ft责)胡as瓣sa树y(E圆MS收A)—ty股pi系ca萄ll赶y,疾w吸it挡h颗sm亿al造le梅r其DN困A疼si降ze煤s.Ch饿ro售ma皱ti愁n-但im陈mu共no继pr搅ec泊ip陷it残at毫io纽奉n勉(C析hI豆P)愤a斯ss花ay载—t镇oas干se殃ss陷o汽cc欢up撇an显cy中o向f萍DN硬A卵si际te版s符wi涂th贤s尤pe案ci钓fi折cfa业ct弓or弦s悼in起l仙iv滚in子g状ce迅ll顺s.Ge锯l烈sh篮if赌t染色榨质免德疫沉忍淀技啊术（ch上ro吴ma随ti野n哥im拿mu句no津pr献ec顿ip恢it宅at故io怖n宜as杆sa踪蝶y,岗C竞HI涝P）——体内午分析泼蛋白循质-D贫NA相互厌作用真核循生物牌基因视组DN络A以染失色质筋的形续式存立在。哑因此奖，研香究蛋励白质耕与DN呢A在染攻色质非环境苏下的拍相互索作用灵是阐骄明真您核生态物基溜因表态达机阀制的舌基本暖途径退。CH伶IP的基爹本原琴理:在活托细胞延状态念下固规定蛋兔白质链－DN御A复合石物，餐并将索其随因机切欺断为再一定慨长度孙范围切内的掌染色迈质小览片段遇，然赠后免站疫沉剂淀此厚复合榜体，外特异晒性地傲富集稠与目帆的蛋远白结堆合的DN忙A片段价，通芝过对寻目的练片断源的纯都化与馆检测芽，从庆而获笋得体擦内蛋绒白质芹与DN姨A相互取作用煤的信贞息。甲醛处理使蛋白质与染色质DNA交联；超声波或酶处理使染色质DNA片段化；抗体沉淀蛋白质-DNA交联复合体（IP）；消化蛋白，解除交联，纯化DNA；检测分析(PCR,qPCR,Microarray)6.基因水或蛋抵白质萍功能通研究改变室基因义结构基因津突变冷（点陪突变月、缺划失、巾融合驰等）将突惜变基究因或郊蛋白脉引入盾细胞黎以检青测其免功能Do吗mi努na欢nt售n缸eg陶at超iv泡e捞mu赚ta谜nt粒s(缺失使结构浪域突丑变体)Li课ga盘nd古-b迅in鬼di棵ng修s决it帆ePh泽os跪ph喷or衰yl置at俗io蜻n锡si烤teDo差ck后in恭g桐si碎tePr携ot糕ei顺n-兰pr恶ot圈ei箩n物bi释nd茂in恨g横si王teDN典A不bi示nd嚷in输g演si拴te基因火表达赴或蛋沾白质路活性尸的抑鸣制，观察坦表型秤变化蹲推测闪基因烤功能RN耐Ai—u径se家o肺f孙sm亡al吃l准in水te恢rf雨er医in洪g法RN雀A完(s也iR杜NA绞)踪蝶to妄r前ed锣uc痕e能sp凝ec畜if饼ic调m警RN微A描le搁ve环ls政.An冶ti棉se矛ns什e宽ol复ig撞on萄uc纽奉le狱ot眼id隐esRi扮bo阅zy蜻meMo搂no犹cl帜on猪al道A鸡nt坡ib缸od昂ySm嚷al挣l虹in匠hi奏bi匹to内r猎mo间le苍cu与le惯s：ty取ro爪si嗓ne板k艘in考as寺e铲in携hi段bi搜to秆r俩(T窑Ki够)在生虚物整好体内歉改变箱基因再表达炒或基无因结痕构（史转基萌因技消术）tr如an障sg抢en黄icKn梅oc艺k-周ou校tRN通A干扰崭技术RN阅A翼In前te盾rf锦er就en它ce创(组RN班Ai投)由双奶链RN亦A所引够起的理序列粘特异帽性基鉴因沉河默长双盾链RN征A被细莲胞源嚷性的本双链RN侵A特异豪的Ｄｉ卫ｃｅ瓦ｒ核酸酸酶切成仰２１阁～２愚３个饼碱基启对的前短双慰链RN浅A，称济为小房诚干扰RN厉A小干怒扰RN效A与细鞭胞源姨性的蓝某些向酶和望蛋白夸质形放成复垫合体戚，称住为RN馒A诱导则沉默跌复合距体，该闻复合困体可筐识别著与小依干扰RN摸A有同虾源序域列的榆ｍRN傲A，并蜡在特您异位童点将雄该ｍRN良A切断愈。RN艳Ai实例(载体店法)：查找贺靶基川因mR伸NA利用承网络把在线已支持滨，寻瞎找si爸RN览A序列根据幕查找比的si带RN购A序列沉，合矿成长控链ol呼ig蚕o构建末载体转染检测间效应弦（包创括干妇扰效并应和提生物硬学效盾应）转基翼因：将人腥工分世离和荡修饰产过的润基因色导入舍到生割物体约基因渡组中展，导默入基竹因的但表达安可引统起生框物体续性状誉可遗发传的材改变找，称颂之为讽转基炕因。转基宣因动交物：以实诉验方守法将招外源蛾基因柱导入腿动物睛染色亡体基顿因组梁内稳姑定整屠合并涨能遗促传给蛙后代本的一降类动甚物。转基末因技堤术tr慈an侍sg涛en伍ic轮t压ec愈hn骨ol喇og庙y转基尼因动妨物模帮型实轰验步遣骤:转基棉因载临体的违构建忽；将转狼基因茧载体衔导入练受精纳卵细逼胞或歪胚胎难干细假胞；将转扎基因沙受精抽卵或舌胚胎刃干细贴胞植黎入假束孕小店鼠子询宫内粮；对转夫基因宴动物油进行备鉴定庄。转基减因载弱体结构夕基因报告嚷基因增强颠子启动宵子受精全能葛性细拳胞注射

植入假孕荷小鼠后代So拐ut猜he扭rn拥b喝lo跑tRT菌-P命CRWe踢st攻er勤n世bl看ot转基浓因小微鼠基因蔽敲除藏技术Ge母ne庆K洽no晕ck纤-o前ut体外义合成爬无效喷基因赴或突心变基友因；定向略插入(同源食重组)宿主悼细胞小染色鉴体DN龙A中取代坛相应形正常王基因,使特挣定目舰的基史因在葡细胞或内或驱生物慨体内仓失活棕；应用稠转基稀因方洁法孵凳育出龟转基伙因动乳物,即为育基因麦敲除组动物想。基因壤敲除婚技术Ge劲ne味K遣no支ck樱-o仁ut信号魂转导叹中第蚀二信终使含塌量的加测定第二菠信使唤含量衫的高京低同炊信号裂传递砖密切私相关惩。1.虚[C屯a2+]的测很定：原子霞光谱兔法、盘离子毁微电惭极测斗定法殊、放贺射示婚踪法劫及标球记示之踪法箭等。俯目前担常用寨标记尝示踪疑法，迹即用连荧光脂探针猾标记择靶细栏胞。蔑常用建的荧械光探妖针有qu怀in牢-2培/A疯m、Fu西ra达-2谈/A动m及In期do把-1等，锄后二胸者较猫为敏无感。2.洒IP3的测酬定：采用3H-万Td习R标记来的肌偶醇标酷记靶恋细胞坛后，台用不射同的谜刺激抬剂刺垦激细仇胞，丧分离邪磷脂爽酰肌秀醇混吓合物撇，通败过阴娇离子蜓交换残层析液柱分默离洗泽脱，颜收集IP3洗脱款峰后锐进行浓液闪驻测定纱。此狸外，叙还可河以使丘用Am冈er揉sh纤am公司原生产岛的D-复my协o-步IP3[3H]分析呈系统闷直接越测定烟粗提慎物中洲的IP3含量袄，此覆方法旬简易炸、敏乘感。3.亭DA威G的测讨定：首先绑提取椒含DA殊G的样牧品，吊用DA满G激酶沃催化费底物DA斤G，使葱之发唐生磷桃酸化汽，外伯源加烈入32γ-偿AT针P，最塞后将圾反应阳产物狡进行溉分离峡后测诊定放弓射性菊含量可，根良据标波准品携计算炭出样裙品中DA室G的含再量。4.凯cA岔MP的测北定：（1）cA示MP绘[3H]分析适系统绪，其盈优点订是放凯射性理