技术原理及应用详解

技术原理及应用详解演示文稿目前一页\总数三十页\编于二十三点优选技术原理及应用目前二页\总数三十页\编于二十三点1RNAi现象的发现及发展目前三页\总数三十页\编于二十三点RNAi的发现目前四页\总数三十页\编于二十三点转录水平转录后水平基因沉默DNA甲基化异染色质形成DNA分子的消融siRNA介导miRNA介导2RNAi的作用机制目前五页\总数三十页\编于二十三点2.1转录水平的基因沉默RNA分子介导的转录水平的基因沉默（transicriptionalgenesilencing，TGS）是指基因信息从DNA到mRNA的转录过程尚未启动时，siRNA分子通过修饰染色体DNA分子或与其结合的组蛋白分子阻碍转录的发生目前六页\总数三十页\编于二十三点2.2转录后水平的基因沉默RNA分子介导的转录后水平的基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）PTGS是指基因信息从DNA到mRNA的转录过程启动后，siRNA分子通过RNA干扰机制降解mRNA或抑制mRNA翻译，也包括在转录启动后siRNA介导的基因第一外显子序列的DNA甲基化。目前七页\总数三十页\编于二十三点2.3RNAi的主要过程起始阶段dsRNA(500nt左右最佳)被Dicer酶特异性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNASmallinterferingRNA(siRNA)长度：21-25ntDicer是一种ATP依赖性RNaseⅢ型核酸内切酶，对单链RNA没有活性，对200~500nt的dsRNA作用效果最好目前八页\总数三十页\编于二十三点siRNA的结构目前九页\总数三十页\编于二十三点2.效应阶段siRNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的形成RISC中解旋酶可依靠ATP供能，解开siRNA双链，激活RISC在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别），RISC中核酸内切酶特异性切割、降解靶mRNA，导致基因表达失活目前十页\总数三十页\编于二十三点3.siRNA扩增阶段RNA依赖性的RNA聚合酶

(RNAdependentRNAPolymerase,RdRp)siRNA可作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链，它在Dicer酶的作用下也被裂解成新生的siRNA。通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。目前十一页\总数三十页\编于二十三点dsRNA外源dsRNA病毒dsRNA其他dsRNADicer双链siRNAP特异性蛋白结合形成RISCsiRNA解链靶序列识别RDRP以siRNA为引物，RDRP催化合成新的dsRNA核酸酶降解mRNAmRNAsiRNARNAi作用机制目前十二页\总数三十页\编于二十三点2.4miRNA介导的RNAiMicroRNAs(miRNAs)是一种大小约为21-25个碱基的非编码单链小分子RNA，是具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶加工后生成(LeeY,2003)。miRNA的功能也是由RISC介导的，最终引起蛋白质翻译受抑或者同源mRNA降解（BartelDP.，2004）。目前十三页\总数三十页\编于二十三点Table1.miRNA和siRNA介导RNAi的区别名称miRNAsiRNA来源內源转录本转基因病毒RNA前体茎环状的pre-miRNA双链结构dsRNA催化酶Dicer或者类似于Dicer的酶复合物Dicer匹配方式不完全互补（动物）或完全互补（植物）完全互补作用目标的专一性（特异性）相对较低高作用点蛋白质合成水平转录后水平大小约22nt约22nt功能发育过程中调节內源基因表达抑制转录活性，病毒感染，表现遗传靶基因的命运抑制转录或者被降解被降解目前十四页\总数三十页\编于二十三点确定目的基因

根据相对应的核酸序列确定dsRNA模板区域

获得dsRNA

用dsRNA转染细胞

分析RNA干扰的效果3昆虫RNAi技术的实验方法RNA干扰研究的一般流程目前十五页\总数三十页\编于二十三点RNAi实验对照设置对照组设置原理普通阴性对照

与目的基因的序列无同源性和目的靶细胞中其它基因同源性很低荧光标记阴性对照

方便地在荧光显微镜下观察转染情况可用于优化转染条件和评价转染效率阳性对照确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法是否可靠

LaminA/C、GFP22、

LuciferaseGL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、GAPDH、CyclophilinB转染试剂对照检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响避免Off-target对照针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验Table2.RNAi实验对照设置目前十六页\总数三十页\编于二十三点1.dsRNA模板的选择选择的dsRNA模板区域不要针对5’和3’端的非编码区通常选择的模板长度约为500bp在合成dsRNA之前，应该先进行dsRNA和其他mRNA的同源性比对3.1dsRNA的获得目前十七页\总数三十页\编于二十三点3.2dsRNA的合成方法1.体外转录法原理：采用5’-末端含有T7、Sp6或T3RNA多聚酶识别序列的寡核苷酸引物进行PCR扩增目的片段，然后在T7、Sp6或T3RNA多聚酶的作用下转录成RNA，通过简单的退火、核酸酶消化和离心等步骤后即可获得dsRNA目前十八页\总数三十页\编于二十三点用于制备长度范围在200bp-1000bp的dsRNA采用Ambion专利的体外转录技术，能合成达

50–80μg

的双链RNA试剂盒包括dsRNA纯化试剂dsRNA合成－MEGAscript™RNAiKit目前十九页\总数三十页\编于二十三点2.构建RNAi表达载体制备dsRNA

表达载体可分为两个类型：单启动子载体，需要插入反向重复DNA（由正义链、间隔序列和反义链组成），在转录的过程中，反向重复序列可产生由内部碱基互补而回折形成的发夹RNA分子，然后加工形成dsRNA；双驱动子载体，将靶DNA置入克隆位点后，双启动子分别表达正义链和反义链，然后在胞内结合形成dsRNA目前二十页\总数三十页\编于二十三点单启动子载体目前二十一页\总数三十页\编于二十三点双驱动子载体——质粒L4440DNA模板（Timmons和Fire，2001）目前二十二页\总数三十页\编于二十三点3.3昆虫RNAi的导入方法dsRNA微量注射法InjectionAdultPupaEmbryoLarvalNanojectIIAuto-NanoliterInjector目前二十三页\总数三十页\编于二十三点Table3.昆虫RNAi的导入方法注射法饲喂法组织培养法操作时期卵、幼虫、蛹、成虫幼虫、成虫培养细胞、胚胎部分幼虫操作方法微量注射器dsRNA人工饲料菌液、转基因dsRNA培养基优点dsRNA迅速到达组织精确地导入dsRNA操作容易、省时、经济不造成机械损伤成活率高大量昆虫同时连续摄取dsRNA适合用于害虫控制适用于长期研究操作简单适用于大规划的基因功能筛选缺点操作难度大、耗时成活率较低难于用于大规模分析基因沉默效率可能较低不同昆虫由于肠道环境不同导致dsRNA摄取效率差异较大昆虫摄取的dsRNA量难于确定基因沉默效率较低需要较高浓度的dsRNA目前二十四页\总数三十页\编于二十三点4RNAi技术在昆虫学研究中的应用

特点：高效、特异性强、快速且经济RNAi技术基因功能研究的优点：RNAi技术不破坏基因的完整性，可以先将特定基因的表达封闭，然后再激活可以同时封闭基因家族或具有高度相似性的一组基因，从而解决由于多个基因的功能沉余造成的难于检测到单个基因突变表型的问题目前二十五页\总数三十页\编于二十三点Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsSilkwormBombyxmori家蚕Circadianclockgeneper(Sandrellietal.,2007)

Transgenics

Disruptionofegg-atchingEcdysis-triggeringhormonegeneETH(Daietal.,2008)TransgenicsLethalatpharatesecond-instarlarvalstage

EgyptiancottonleafwormSpodopteralittoralisβ-actingene(Gvakhariaetal.,2003)InjectionDisruptionofspermreleaseCircadianclockgeneper(Kotwicaetal.,2009)InjectionDelayedspermreleaseLightbrownapplemothEpiphyasPostvittana苹果浅褐卷蛾CarboxylesterasegeneEposCXE1andpheromonebindingproteingeneEposPBP1(Turneretal.,2006)FeedingInhibitionofgeneexpressionCottonbollwormHelicoverpaarmigeraCytochromeP450geneCYP6AE14(Maoetal.,2007)FeedingInhibitionoflarvalgrowthGlutathione-S-transferasegeneGST1(Maoetal.,2007)FeedingSuccessfulinhibitionofgeneexpression目前二十六页\总数三十页\编于二十三点InsectsGenesandReferencesMethodsEffectsBeetarmywormSpodopteraexiguaChitinsynthasegene(Chenetal.,2008)InjectionDisorderintheinsectcuticle,noexpansionofthelarvaltracheaepithelialwall,andotherlarvalabnormalitiesJapanesepinesawyerMonochamusAlternatus松墨天牛LaccasegeneMaLac2(Niuetal.,2008)InjectionPupalandadultcuticlesclerotisation,deathatahighdoseRedflourbeetleTriboliumcastaneumChitinsynthasegenesTcCHS1andTcCHS2(Arakaneetal.,2005)InjectionDisruptioninalltypesofmoulting(larva-larva,larva-pupa,andpupa-adult),cessationofingestion,decreaseinlarvalsize,andreductionofchitincontentinthemidgutChitinase-likeproteinsTcCHT5,TcCHT10,TcCHT7,andTcIDGF4(Zhuetal.,2008)InjectionEffectsonpupal-adultmoultingEffectsonegghatching,larvalmoulting,pupation,andadultmetamorphosis.Effectsonabdominalcontractionandwing/elytraextension.Effectsonadulteclosion续Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsects目前二十七页\总数三十页\编于二十三点续Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsWesterncornrootwormDiabroticavirgiferavirgiferaLeConte玉米根萤叶甲

VacuolarATPase(v-ATP)(Baumetal.,2007)FeedingDelayedlarvaldevelopmentandincreasedmortalityStripedfleabeetlePhyllotretastriolataArgininekinasegeneAK(Zhaoetal.,2008)FeedingDelayeddevelopment,increasedmortality,andreducedfertilityMediterraneanfieldcricketGryllusBimaculatus蟋蟀Circadianclockgeneper(Moriyamaetal.,2008)InjectionCompletelossofcircadiancontroloflocomotoractivityandelectricalactivityintheopticlobeNitricoxidesynthasegeneNOS(Takahashietal.,2009)InjectionDestructionoflong-termmemory目前二十八页\总数三十页\编于二十三点续Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMethodsEffectsGermancockroachBlattellaGermanica德国小蠊BgRXRgene(Martinetal.,2006)InjectionInhibitionofpupaleclosionPigment-dispersingfactorgenepdf(Leeetal.,2009)InjectionEffectsoninsectnightactivityAmericangrasshopperSchistocercaAmericana美洲沙蝗Eyecolourgenevermilion(DongandFriedrich,2005)InjectionSuppressionofommochromeformationandsystematicexpressionBrownplanthopperNilaparvataLugens褐飞虱Trehalosephosphatesynthase(TPS)(NlTPSmRNA)(Chenetal.,2010FeedingDisturbeddevelopmentthroughdisruptionintheTPSenzymaticactivity,reductionofinsectsurvivalrateTurnipsawflyAthaliarosaeArwhitegene(Sumitanietal.,2005)InjectionWhitephenocopyinembryoniceyepigmentation目前二十九页\总数三十页\编于二十三点续表Table4.RNAiresearchonfunctionalgenesininsectsInsectsGenesandReferencesMetho