DB65T 4292-2020牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测方法

ICS11.220牛羊布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)检测方法2021-01-01发布新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布I830004新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话传邮编：830004乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心联系电话传邮编：哈尔滨平河生物技术有限公司联系电话13845067089;传真15.396孔黑色平底不透明微量板(聚苯乙烯板)。25.5旋涡振荡器。6.1标准阳性血清：布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。6.2标准阴性血清：布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂。6.3FPA标记抗原：布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置方法见附录A。6.410×FPA样品稀释液：布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或试剂自行配置方法见附录A。7操作方法7.1样品采集和处理按照NY/T541和DB65/T3893中的方法采集和分离受检牛、羊的血清，分离后的血清应没有溶血现象，血清量通常为1mL备用。7.2操作前准备工作7.2.1将试剂和样品恢复至室温18℃~28℃。检测操作应在室温18℃~28℃下进行。7.2.210倍FPA样品稀释液：在商业化稀释液瓶中加入200mL(电阻为18.2mohms)的去离子水，混合均匀后为1×FPA样品稀释液，直接使用。7.2.3FPA标记抗原，直接应用。7.3试管检测法7.3.1对照阴阳性血清检测每天第一次试验前或FPA检测仪被移动后，都要检测对照血清。在两个10mm×75mm硼硅玻璃试管(试管应清洁无指纹等，且无刮痕)中分别加入1mL的分别在两个试管中加各入10μL的阳性和阴性对照血清，充分混合均匀(旋涡混合器振动5s)。使用试管型便携式FPA仪分别读取两管的空白密度值。每管加入10μL的FPA标记抗原，充分混合均匀(旋涡混合器振动5s)。孵育至少2min,最长不超过5min。使用便携式FPA仪读取两管的mP值。试管的检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。对照结果：阴性对照牛血清的mP值应低于90mP(通常在75mP左右);阳性对照牛血清的mP值在200mP左右。如果对照成立，再进行样品检测。否则，按照FPA仪器的操作软件和操作程序，调试便携式FPA仪的参考因子值，直到满足对照结果成立的数值，才可进行样品的检测。7.3.2样品检测在10mm×75mm硼硅玻璃试管加入1mL的1×FPA样品稀释液(一个试管加一个样品)。在上述试管中加入10μL的牛血清(或25μL绵羊血清、或40μL山羊血清),充分混合均匀(旋涡混合器振动5s)。不同畜种血清稀释度不同，具体如下：a)牛血清1:100(即10μL血清加到1.0mL样品稀释液中);b)绵羊1:40(即25μL血清加到1.0mL样品稀释液中);c)山羊1:25(即40μL血清加到1.0mL样品稀释液中)。使用试管型便携式FPA仪读取被检样品试管的空白密度值。3在上述试管中加入10μL的FPA标记抗原，充分混合均匀(旋涡混合器振动5s)。孵育至少2min,最长不超过5min。使用试管型便携式FPA仪读取被检样品的mP值。试管的测量顺序与读取空白密度值时的顺序一致。结果判定：被检样品mP值大于其阈值时，判为阳性；mP值小于阈值时，判为阴性；mP值等于阈值时，需重做。.1没有接受疫苗接种的动物，阳性与阴性之间的临界值是：a)牛血清为95mP;b)绵羊血清78mP.2接种疫苗(6～9)个月后：a)牛血清<95mP为阴性；95mP～115mP为可疑；>116mP为阳性；b)绵羊<78mP为阴性；78mP～88mP为可疑；>88mP为阳性；c)山羊<88mP为阴性；≥88mP为阳性。7.4微量法检测7.4.1对照阴阳性血清检测每天第一次试验前或FPA检测仪被移动后，都要检测对照血清。在干净的黑色96孔板的第一列中的6个孔中分别加入190μL的已稀释的1×FPA样品稀释液。振动2min,充分混合均匀。使用台式FPA仪读取平板的空白密度值。每孔加入10μL的FPA标记抗原，振动2min,充分混合均匀。孵育至少2min,最长不超过5min。使用台式FPA分析仪读取平板的检测密度值mP值。检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。对照结果：阴性对照血清的mP值应该低于90mP(通常在75mP左右);阳性对照血清的mP值通常在200mP左右。如果对照成立，再进行样品检测。否则，按照FPA仪器的操作软件和操作程序，调试FPA检测仪的参考因子值，直到满足对照结果成立的数值，才可进行样品的检测。7.4.2样品检测在干净的黑色96孔板中每个孔加入190μL的已稀释的1×FPA样品稀释液。其中设置阳性对照和阴性对照孔各两个。向每个对照孔和样品孔中分别加入10μL的阳性、阴性对照血清和被检牛血清(一个孔检测一个样品),室温下振动2min,充分混合均匀。96孔板置入荧光偏振检测仪中进行第一次读数，得到对照血清和样品的空白值。从FPA检测仪上取出96孔板向每个孔中分别加入10μL的FPA标记抗原，室温下振动2min,如台式FPA检测仪是非自动加样的，需要将96孔板置入荧光偏振检测仪中进行第二次读数，得到对照血清和样品的mP值。平板的测量顺序与读取空白板时的顺序一致。如台式FPA检测仪是自动加样的，后续程序设置好后，仪器自动加入10μL的FPA标记抗原、然后振动2min,充分混合均匀；再孵育至少2min;FPA检测仪进行第二次读数，得到对照血清和样结果判定：阴性对照血清的读值必须介于(60～90)mP之间，阳性对照血清的读值必须介于(140～300)mP之间，当二者读数都成立时，才能对样品进行判断。待检血清样品mP值大于其阈