全面的质粒抽提纯化疑难解答

/全面的质粒抽提纯化疑难解答来源:生兴生物质粒抽提该实验成功的标志是去除RNA,将质粒与细菌基因组DNＡ分开，去除蛋白质及其它杂质,得到相对纯净的质粒。图：质粒大量抽提1。常用试剂用途（１）溶液I：葡萄糖/Tris-Cl／EDTＡ，pH8.０。溶霉菌:水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-１，4糖苷键，因而具有溶菌作用.葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，防止ＤＮA受机械剪切力作用而降解。Trｉs-Cl：控制ＰH值。ＥDTA：螯合Ｍg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（ＤNasｅ作用时一定的金属离子作辅基)。有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。(2）溶液II:新鲜ＮａOH/SDＳ.新鲜NaOH：NaOＨ是溶解细胞的试剂，用新鲜的NaOH是为了保证NaＯH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性.核酸在pＨ值为5~９的溶液中是最稳定的，但ｐH大于12或小于３时,就会引起双键之间氢键的解离而变性.在溶液Ⅱ中的ＮaOH浓度为0.2Ｎ，加入提取液时,该系统的ｐＨ就会高达12．6，因而促使染色体DNＡ与质粒DNA的变性。SDS:SＤS为阴离子表面活性剂，主要功能有:溶解细胞膜上的脂肪与蛋白,从而破坏细胞膜;解聚细胞中的核蛋白，SDS-蛋白质结合为复合物,使蛋白变性沉淀下来，但ＳDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净，以防用RＮase去除ＲNA时受到干扰.（３）溶液III：醋酸钾（KＡc)缓冲液ＫAc:用pＨ4。8的ＫAc溶液是为了把pＨ12。6的抽取液pH调回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在.而高盐的３mol∕ＬKAc有利于变性的大分子染色体DNA、ＲNＡ以及SDS—蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷。减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SＤS－蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀完全。（4)苯酚/氯仿／异戊醇：沉淀蛋白质.酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。异戊醇其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。（5）乙醇:沉淀质粒DNＡ。此为实验中最常用的沉淀方法.DＮＡ溶液时以水合状态稳定存在的ＤNＡ，当加入乙醇时,乙醇会夺去DNＡ周围的水分子,使DNA失水而易于聚合.乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。使用乙醇在低温条件下沉淀ＤNA,分子运动大大减少，DNＡ易于聚合而沉淀，且温度越低,DNA沉淀得越快。(6)氯霉素：大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事,而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等.而在细菌繁殖的对数生长期中期加入氯霉素还可以增加质粒DNA的拷贝数,也可以抑制在需要大量制备质粒时,细菌增长过多,便于质粒的抽提。２.纯化方法常使用的所有纯化方法都利用了质粒ＤNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如,用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体ＤNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DＮA分子的结合量有所不同.溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与ＤNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DＮA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DＮA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和（每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子）。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环ＤNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。一些大肠杆菌菌株（如ＨB１01的一些变种衍生株）用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类,当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦.糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DＮA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒ＤNA内污染有糖类,而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HＢ101和ＴG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法多年来，氯化铯—溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法。然而该过程既昂贵又费时,为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNＡ和宿主DＮＡ的方法。３.疑难问题解答Q:质粒DNA不能被限制酶所切割？A：可能是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够，吸入了杂质。可以用酚：氯仿对溶液进行抽提以去除小量备物中的杂质。如果依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA.乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分,残留的盐类会影响酶切.Q：加入溶液Ⅲ后，细菌碎片贴壁不紧，不能形成致密沉淀块？Ａ：由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。Q:加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，摇动时用力适当?Ａ：因为既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性；又要使染色体DＮＡ不断裂成小片段而能与质粒ＤＮA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，不可过分用力。Q：加入溶液Ｉ蜗旋振荡时,发现菌体呈絮状不易混匀,或成细砂样。Ａ:很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间、降低培养温度,通常降低培养温度会使细菌生长更加稳定。同时也要注意是否有其他菌污染。Q：加入溶液II，菌液浑浊度没有发生明显变化。Ａ:裂解不完全，主要问题是发生在溶液ＩI上。确保10％SDS是澄清的，确认NaOH是有效的.Q：手工提取质粒,使用PEG８0０0纯化的问题。A：分子生物学使用级别ＰEG8000不需要灭菌。加入PＥＧ80００前，质粒应该溶解在TE中，而不是含有大量其它杂盐得溶液。用PEG8０0０纯化前,质粒溶液经过乙醇或异丙醇沉淀，且经过7０%乙醇漂洗过的。沉淀步骤在冰上或4度进行。PEG8000的沉淀是透明的,有时可以看到沉淀，而有时很难辨出沉淀,但后续酚仿抽提时会在水相和有机相间出现大量白色沉淀层.Q：没有提出质粒或者质粒收获量很低。A：可能是菌种老化，涂布或者划线菌种,重新挑选单菌落进行液体培养。如果是低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量,并相应增加各种Ｂｕffer的用量。可能是洗脱液pH值不正确，将DＮA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0－8．5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果。Q：加样时DNA飘出加样孔外.A:可能是柱中残留乙醇未除干净。Q：如何将质粒与细菌基因组ＤNA分开。A：一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让质粒从细菌中释放出来,而不让基因组DNA从细菌中出来。二是利用ＮaOH/ＳDＳ完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组DNA都从细菌中出来，再利用质粒和基因组DNＡ在变性/复性过程中的不同表现，将质粒与基因组ＤＮA分开。Q：菌体的悬浮要彻底Ａ：如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液II加入后,变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。这个团块在溶液III加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。Ｑ：裂解时间对提取的影响A：加入溶液II后，混匀，体系最好立即变得清澈。体系如果变得清澈了,马上加入溶液IIＩ中和。如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液III。Q：怎样使蛋白沉淀完全。A：在1。５ml离心管中加入溶液III后,先颠倒两次,使管底朝上,用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好.Q：怎样降低基因组ＤNA残留？Ａ:操作过程中要尽可能不打断基因组DNA。裂解体系越粘稠,基因组DＮＡ越容易被扯断；操作手法越重，基因组DNA也越容易被打断。温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低基因组DNA残留的最好方法。Q：如何降低变性超螺旋?A:用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的，因此抽提时可使用相对过剩的溶液，在加入溶液II后,体系能在1分钟内变澄清,再快速加入溶液IIＩ，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。Ｑ：从有些宿主菌中抽提质粒